Способ получения антибиотического комплекса тенебримицина Советский патент 1980 года по МПК C12D9/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ТЕНЕБРИМИЦИНА

1

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к получению антибиотиков.

Предложенный антибиотический крмп-5 леке новый и способ его получения в патентной и научно-технической литердтуре не описан.

Целью изобретения является получение антибиотического комплекса тене- JQ бримицина, содержащего фракции тенебримицина 1,, 1 и 11.

Эта цель достигается тем, что штамм Streptomyces tenebrarlus АТСС 17921 выращивают в питательной среде,j содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях при температуре 37-43°С в течение 4.-7 дней, вьщеляют антибиотический комплекс в свободном 20 виде или в виде его солей и/или разделяют на составляющие его фракции.

Штамм Streptomyces tenebrariiis вьаделен из образца почвы посредством суспенднровгшия отдельных порций об- 25 разца почвы в стерильной дистиллированной воде с последукщим переносом суспензий на питательную среду.

Штамм Streptomyces tenebrartus хранится в коллекций культур американского типа в Вашингтоне (Федеративный округ Колумбия ОНА) под номером АТСС 17921.

Культурапьно-морфологические признаки . Воздушный мицелий и споры отсутствуют, фрагмент мицелия в состоянии вегетации в незначительных количествах.

Агар Чапека. Вегетативный рост удовлетворительный, цвет желтоватобелый , воздушный мицелий и растворикый пигмент отсутствуют.

Агар, содержащий кальциевую соль яблочной кислоты. Вегетативный рост умеренный, цвет сероват.о-желтый, воздушный мицелий отсутствует, незначительное количество сероватокоричневого растворимого пигмента,

ПирозинОвыЙ агар. Вегетативный рост умеренный, цвет серовато-желтый, воздушный ющелий и раствори- мый пигмент отсутствуют.

Агар с неорганическими солями и крахмалом. Вегетативный мицелий удовлетворительный, цвет светлый, желтовато-коричневый растворимый пигмент.

Агар с глюкозой и аспарагином. Вегетативный рост умеренный, цвет

серовато-жёлтый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Td TifiSH nacta с. йвсяной мукой. Вегетативный мицелий умеренный, цвет желтый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Дрожжевой экстракт. Вегетативный мицелий умеренный, цвет светлый, желтовато-коричневый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют .

Питательный агар. Вегетативный рост умеренный, цвет светло-желтый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Агар Беннета. Вегетативный рост умеренный, цвет серовато-желтый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.

Физиологические, признаки. Дейст ие на молоко: толстое окрашенное кольцо роста на поверхности, наблюдается коагуляция и пептонизация.

Нитраты восстанавливает..

Сероводород не образует.

Полностью сжижает желатин через 7 дней.

Растет при температуре 26, 30, 43, 49 и , оптимальная температура роста .

Хорошо усваивает фруктозу, манноЗУ, глюкозу, мальтозу, трегалозу, i-инозитол.

Не усваивает серабинозу, рамнозу, рибозу, лактозу, сукрозу, раффинозу, целлюлозу, маннитол, d-сорбитол, салицин.

Штамм Streptomyces tenebrarius АТСС 17921 культивируют в условиях погруженной аэробной культуры в среде, содержащей ассимилируемь1е источники углерода, азота и неорганических солей.

Штамм растет при температуре от 30 до ЗО-с, оптимальные температуры 37-43с.

Штамм чувствителен к действию света и плохо растет при освещении, поэтому .ферментацию осуществляют в отсутствии видимого света.

Через среду для выращивания культура продувают стерильный воздух. Объём воздуха, используемый в процессе ферментации в крупных резервуарах, составляет свыше О,1 объема воздуха в минуту на один объем среды.

Концентрация, характеризующая активность антибиотика в ферйентационной среде, может быть прослежена посредством отбора и испытания проб среды для выращивания на их активность в отношении ингибирования рОста организмов, которые должна тормозиться в своем развитии в присутствии тенебримицина. Для этой цели применяют организмы К1ebsiel Га pneumoniac и Мicobacter1 urn butyricum.

Мицелий и нерастворившиеся остатки удаляют из ферментационного бульона фильтрацией или центрифугированием. Антибиотик содержится в профильтрованном бульоне и может быть извлечен из него путем адсорбции. К числу адсоЕ бентов, которые могут быть использованы, относятся катионообменные смолы, например, IRC-50.

Тенебрикйщин из ферментационного бульона извлекают следующим образом.

Бульон отфильтровывают с применением средств, способствукнцих фильтрованию, после того, как показатель

рН снижен до 2 добавлением кислоты, например, .серной,фосфорной, хлористоводородной и других подобных им. После этого рН фильтрата доводят до 5 5 добавлением концентрированной щелочи, и смесь снова фильтруют. Полученный фильтрат пропускают через ионообменную колонку, заполненную ионообменной смолой I RC-5 О в аммонийном цикле.

0 Затем колонку промывают дистиллированной водой, и антибиотик извлекают с адсорбента вымыванием разбавленной кислотой.Фракции,содержащие активное действующее начало, объединяют

5 и концентрируют приблизительно до . 1/20 от первоначального объема. рН концентрата повышают примерно до 11 добавлением концентрированной щелочи, после чего щелочной концентрат выливают в шестикратный объем ацетона, хорошо перемешивают и охлаждают. Выделяющийся осадок, не обладающий активностью в микробиологическом отношении, устраняют фильтрованием, рН фильтрата понижают до 3,5 добавлением 20%-ной серной кислоты при тщательном перемешивании. Тенебримицин в виде комплекса осаждается в форме сернокислой соли. Сернокислую соль тенебримицина растворяют в минимальном

0 количестве воды и водный раствор пропускают через колонку с Доуэксом. .

Водный раствор сульфата тенебримицина доводят в колонке дистиллированной водой, после чего жидкость,

5 вытекающую Из колонки, собирают в

виде отдельных фракций. Активные фракции объединяют и концентрируют до консистенций густого сиропа, затем высушивают с целью получения тенеQ бримицина в виде свободного основания.

Основной фактор, образующий комплекс тенебримицина можно получить, если это желательно, в виде раздельных антибиотиков посредством дополнительного фракционирования на колонках, заполненных ионообменной смолой тенебримицина, полученного как описано выше. Для проведения фракционирования Тенебримицин применяют в виде соли, являющейся п одуктом присоединения кислоты. Пригодной солью является в данном случае сульфат. Раствор сульфата тенебримицина удобно получать посредством приготовления 20%-ного водного раствора тенебрими5 цина с последуклией установкой показагеля рН раствора приблизительно 4,5 путем добавления серной кислоты. Окршенные примеси можно с помощью перемешивания приготовленного как указано раствора примерно с 5% (весое количество по отношению к объемному) активированного угля,такого например,как Дарко G-60.Эффективно обесцвечивание достигают в результате перемешивания смеси, содержащей активированный уголь, в течение одного часа. После этого смесь фильтруют, и фильтрат, который содержит сульфат тенебримицина, помещают в колонку, заполненную ионообменной смолой марки {RC-50 в аммонийном цикле. Колонку промывают водой, после чего индивидуальные антибиотики, образующие комплекс тенебримицина, фракционированно отмывают в адсорбенте с помощью 0,1 н.раствора гидрата окиси аммония. Процесс элюирования идет медленно, и для получения эффекта фракционирования комплекса обычно бывает необходимо очень большое, число фракций. Так, например, полное и законченное фракционирование примерно,250 г тенебримицина требует получения около 700 фракций, каждая из которых содержится примерн в 900 мл жидкости, откываемой с гшсорбента.,

Первая полученная активная фракци содержит тенебримицин.

Пример 1. Ферментация S.tenbrarlus штамма АТСС 19721,

Спорулированную культуру S.tenebrarius АТСС 17921 получают посредством выравнивания организма на модифицированной среде Беннета в виде скошенного агара, имеющего следующий состав, г:

10,00

Декстрин

Дрожжевой экстракт 1,00

(Дифко)

Гидролизованный

казеин (продукт под

наименованием NZ2,00

амин А)

Экстракт из мяса круп1,00 ного рогатого скота 0,01 CaClj 6H,jO

20, оа

Промытый агар

Деионизированная

До 1000 мл

вода

Значение показателя концентрации водородных ионов рН доводят до 7 до автоклавирования.

Скошенную среду засевеиот спорами S.tenebrarlus АТСС 17921 И культивируют в отсутствии видимого света в течение пяти дней при температуре . Культуру, выращенную на скошенной среде, покрывают водой, и наклонную поверхность осторожно соскабливают, удаляя споры с целью получения водной суспензии, содержащей споры.

Полученную указанным образом суспензию спор применяют для инокулирования среды, имеющей состав, вес.%:

Декстроза

0,050 Питательная соевая мука, содержащая 35-45% диспергирую1,500 щегося протеина Декстрин с низким

1,000 содержанием хлоридов

ХЛОрИСТЬГЙ КсШЙЙ 0,100

o

NZ-амин А 0,300 0,050 MgSO . THjpO 0,500

СаСГ, 0,025

Деионизированная S водаОстальное.

Инокулированную вегетативную среду инкубируют при температуре около в течение 16 ч на аппарате для перемешивания путем встряхивания при 0 одновременном вращении со скоростью 250 об/мин.

Для инокулирования резервуара для посева емкостью 44 л берут водную среду следующего состава, вес.%:

Декстроза1,000

5

Соевая крупа1,500

КНаРОл0,050

MgS040,500

Хлористый КсШИЙ0,100

CaClj-2 чО0,025

0

Средство против вспенивания0,025

Применяют порцию вегетативной культуры объемом 50 мл.

Среду, иаходящуюся в резервуаре

5 для посева, стерилизуют при 120с в течение 30 мин. Ииокулированную среду в резервуаре для посева инкубируют при в течение 12 ч. Переманивание со скоростью 370 об/мин

0 начинают немедленно после инокулирования . в продолжение всего периода инкубирования осуществляют аэрацию при скорости подачи воздуха 0,22 ,

К концу периода инкубгщии содержимое резервуара для посева исполь5зуют для инотсу/хирования ферментатора емкостью 1,14 м1 или 0,95 м, содержгицего среду следующего состава, вес.%:

Декстроза4,0

0

Соевое масло рафинированное3,0 . Соевая му.ка3,0 Хлористый гшмоний 0,5 Хлористый кальций О,3

5 Сернокислый аммоний 0,2 Азотнокислый аммоний 0,1 М2-амин-А 0,5 Средство против образования; пены 0,2 Деионизирсваниая вода Остальное.

0 До инокулирования ферментационную среду стерилигзуют 30 мин при 120 С, ферментацию проводят при . Аэрацию осуществляют при скорости подачи воздуха 0,48 fi течение всего периода выращивания начиная от ниокулирования j кончая сбором выращенной культуры. Перемешивание начинают при скоростивращения мешалки 120 об/мин. Через 12 ч число оборотов мёшалки увеличивают до 180. Процесс ферментации продолжают 5 дней. Полученный путем профильтрованный бульон после ферментации содержит комплекс, имеющий главным образом тенебримицин 11 и в меньшей пропорции - тенебримицин 1 и 1 . Пример 2. Изолирование комплекса тенебримицина. Значение показателя концентрации водородньах ионов у 880 л фермента цйонного бульон а, сЪдержащё го антибиотик и ;полученного, как указано в примере 1, понижают приблизИТШ1ВнЪ до рН-2 путем добавления 10-15 л 20%-ного водного раствора серной кис лоты. К подкисленному бульону добавляют 45 кг средства, способствующего фильтрованию, тщательно перемешивают смесь и фильтруют. Отжатый осадок, оставшийся на фильтре, промывают водой и промывные воды добавляют к фильтрату. рН фильтрата доводят до 5,5 посрёдствбм добавления 50%-нбгб водного раствора гидрата окиси натрия,Добавляют примерно 4 кг средства,способствующего фильтрованию, смесь тщательно перемешивают и фильтруют. Полученный фильтрат пропускают через колонку, имеющую размеры 10,2 см х X 1,8 м (4 дюйма х 6 футов), заполненную ионообменной смолой марки IRC-5p. Колонка имеет слой смолы высотой 111 7-114,3 см и действует по аммонийному циклу. После того, как весь фильтрат пропустят через , гШслёднюй лированной водой в количестве около 200 л. Активное действующее начало, характеризуемое свойствами антибиотика, затем отмывают с адсорбента в течение 12-15 ч примерно 150-175 л 0,1 н.раствора серной кислоты. Элюат собирают в виде фракций по 10 л каждая. Присущая антибиотику активность в составе элюата становится распозна ваемой в случае снижения величины рН до 4 или несколько менее. По мере продолжения отмывки рН элюата продол жает снижаться до тех пор, пока его значение не достигнет ,5. фракции содержащие активное начало антибиотика, объединяют и концентрируют при уменьшенном давлении приблизительно йо 1/20 от пе рвоначального дёъёма. рн ;т шдёШрйего аИне1С)эЯк атайЬвй дят до 11 добавлением 50%-ного водно --Гб рает браГйд зат-аЪййсинатрйя, по ле чего подщелоченный концентрат до бавляют к 6 -ти объемам ацетона. Полу 1ейную смбсь охлаждают и отставляют в сторону для того, чтобы, дать отделиться осадку, лишенному активности, свойственной антибиотику. Затем смесь фильтруют и плотную массу, отжатую на фильтре, и состоящую из неактивного осадка, отбрасывают. рН ус1 анавливают 3,5, добавляя при тщательном перемешивании 20%-ный водный раствор серной кислоты. Во время такой обработки комплекс тенебримицина осаждается в виде сульфата. Практически полное осаждение достигается при рН раствора около 4 или несколько менее. Смесь фильтруют и фильтрат содержащий церуломицин, попутно образующийся в процессе ферментации, отбрасывают. Отжатый на фильтре осадок, являю- щийся сульфатом тенебримицина, раствоР1ЯЮТ в минимальном количестве воды и охлаждают. Все твердые вещества, растворяющиеся более или менее трудно, отбрасывают, наряду со всеми твердыми веществами, выпадающими в виде осадка или кристаллизующимися при охлаждении, прозрачный раствор сульфата тенебримицина пропускают через насадку из ионообменной смолы марки Дауэкс 1x1 размером 10,2 см х 2,1 м, работакяцую по основному циклу. Раствор антибиотика выводят из колонны с применением 40-50 л дистиллированной воды. Жидкость, выходящую из колонны, собирают отдельными фракциями,до 10л. Активные фракции объединяют, концентрируют в вакууме до консистенции густогсо сиропа, который после высушивания на противне дает сухой тенебримицин. Пример 3, Сульфат тенебримицина,, содержащий факторы 1, i и 11 получают путем добавления концентрированной серной кислоты к 20%ному водному раствору, содержащему 258 г комплекса тенебримицина в виде свободного основания, с таким расчетом, чтобы рН среды стало равным 4,5. Полученный таким путем раствор сульфата тенебримицина перемешивают примерно один час с 5% (весовое количество по отнопению к объемному) активированного угля марки ДаркоС-60. Затем раствор фильтруют и фильтрат пропускают через колонку размером 9x105 см, заполненную примерно 7 л ионообменной смолы марки IRC-50 и работающую в аммонийном цикле. После того, как фильтрат, содержащий соль антибиотика был пропущен через колонку, ее пpo Фlвaют приблизительно 17 л деионизированной воды. Вымывание активной части антибиотика, задержанной и колонке, начинают с помощью 0,1 н,раствора гидрата окиси аммония, подаваемого со скоростью около 20 МП в 1 мин. Элюат собирают отдельньаш фракциями приблизительно по 900 мл, причем каждую фракцию проверяют на микробиологическую активность. Фракции, содержащие фактор антибиотика 11 объединяют и высушивают из замороженного состояния с целью получения индивидуального высушенного тенебримицина Ц. П р и м е р 4. Получение гелианта та тенебримицина 11. 2 г тенебримицина 11 растворяют в 22 мл воды и рН раствора доводят до 5 50%-ной серной кислотой Затем к раствору антибиотика добавляют горячий 10%-ный водный раствор метил-оранжа. Гелиантат тенебримицина 11 выделяют в виде осадка, который отделяют фильтрованием. Твердую соль тщательно промывают горячей водой и высушивают в вакууме. В итоге полу чают 3,5 г гелиантата тенебримицина 11. Тенебримицин 11 является белым твердым веществом. Электрометрическо титрование в водной среде показывает наличие способных титроваться группировок, имеющих значения рН Около 5,7; 6,7/ 7,7 и 8,7. Удельное вращение, определяемое в свете линии D натрия при температуре , обусловленное данным фактором, равно +159, если концентрация антибиотика 1%, считая на весовое количество, приходящееся на единицу объема в водном растворе. Тенебримицин 11 имеет следующий состав, %: С 46,47; Н 7,99; N13,05} О 32,29.. Молекулярный вес по результатам титрования около 539. Эмпирическая формула С2 Нд О,,. Инфракрасный спектр поглощения тенебримицина 11 в среде, содержащей минеральное масло, имеет следующие различные полосы в составе спектров инфракрасного поглощения в пределах от 2 до 15 мкм: 3,02; 3,14 6,05; 6,23; 7,4; 8,5,- 8,75/ 9,17; 9,65; 10,11; 11,7; 12,6 мкм. Тенебримицин 11 образует ацетильное производство, имекнцее С около 4-130 при концентрации соединения 1%, считая на весовое количество, приходящееся на единицу объема в вод ном растворе. У производного не имее ся оставшихся группировок, способных титроваться. Элементарный состав, определенный по методу микроорганизма, показывает, что к структуре тене бримицина 11 были присоединены четы ацетильные группировки. Соли, являющиеся продуктами присоединения кислот к тенебримицину или отдельным компонентам, входящим в состав антибиотика, можно получить с помощью обычных методов. Для обра зования соли можно применять или ор ганические или неорганические кисло ты. Удобный метод получения таких солей заключается в добавлении раствора кислоты, служадей для образова ния, к водному раствору антибиотика В случае нерастворикалх солей являю щихся продуктами присоединения кислоты, соль осаждается из раствора и легко отделяется с помощью об згчных технических приемов, таких как фильтрование или центрифугирование.В случае, когда желаемая соль, являющаяся продуктом присоединения кислоты, не осаждается с достаточной легкостью, процесс осгикдения можно усилить, концентрируя раствор до меньшего объема или добавляя к воде смбшивакяцийся с ней растворитель, такой как ацетон или подобный ему. Соль, являющаяся продуктом присоединения кислоты, можно без труда снова перевести в форму свободного основания путем пропускания водного раствора соли над анионооёменной смолой в гидроксильном цикле. Различные факторы, образуницяе тенебримициновый комплекс, можно отличить один от другого, 5 также от других антибиотиков, обладающих сходными свойствами, с помощью технических приемов бумажной хроматографии. Хроматографию проводят по нисходящему методу при температуре 22,В+0,. Константа миграции для каждого из антибиотиков выражена как константа Rq а отличие от более распространенного значения R. Значение константы Rot выражает соотнсяаение между расстоянием, проходимым антибиотиком, по отношению к концу ленты скорее, чем фронт растворителяТенебримицин обладает ингибирующим действием по отношению к росту микроорганизмов, патогенных для жизнедеятельности животных и растений. Ингибирующие концентрации, при которых проявляется тормозящее действие, приведены в таблице. Минимальные ингибирукяцие концентрации были определены по методу разбавления агара со свободным основанием. Острая токсичность тенебримицина 11 отмечается при внутривенном введе-. НИИ мыдам в дозе, около 385. мг/кг. Новый комплексный антибиотик, соответствующий настоящему изобретению получается в результате культивирования. Стафилококкус ауреус 30556,25 Бациллус субтилис 1,56 Микобактериум авиум 1,56 Стрептококкус фекалис3,12 Лактобациллус казей50,00

Продолжение таблицы

.7-

Лвйкояосток центрофор

Эшерихия коли W 1

Эшёрихия коли N12

Протеус СП. 1

Протеуо СП. № 2

Псевдомонас сп. I 2

Йсвёдомонас сп. в 5

Клебсиелла аэробактер

14 .

Клебсиелла аэробактер

15

Сальмонелла сп. 1

Вибрир мечниковии

Агробактериум тумефациено

Продолжение таблицы

J.

Эрвйнйя амилофс5| а 1,56

Псевдомонас соланацерум 25,00

5 Ксантомон&с фазеоли 12,50

Предлагаемой способ позволяет получить HOBfcitt аитйбиотический комплекс ; ейёбримицина.

. Формула изобретения

0 Способ получения антибиотического комплекса тейебримицина, содержащего фракции тенебримицина 1, 1 и 11, отличающийся тем, что, штамм Streptomyce.s tenebrartus

5 АТСС 17921 выращивают в питательной х;реде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях при температуре 37-43с в течение 4-7 дней, вьщеляют

Q антибиотическими комплекс в свободном виде или в виде его солей, и/или разделяют, на составлякицие его фракции.