Способ определения витамина @ Советский патент 1984 года по МПК G01N31/08 

со

О5

со Изобретение относится .к аналити ческой химии, в частности к способам определения филлохинона (витамина К), и может использоваться в различных аналитических лаборато риях. Известен способ определения вит мина KJ, в экстрактах растительньпс материалов на пластинке, покрытой слоем окиси алюминия с использованием в качестве подвижной фазы гек сана и реактива обнаружения 1%-ного раствора 2,6-дихлорфенола или 70%-ной перхлоруксусной кислоты и индофенола lj. Недотатком данного способа является недостаточно высокая эффективность разделения витамина К 1 и сопутствующих компонентов (степень разделения не превышает 1,1). Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ опре деления витамина К путем экстрагирования его из образца гексаном, очисткой экстракта с последующим хроматографированием экстракта на пластинке со слоем силикагеля в подвижной фазе гексан - эфир, при соотношении компонентов 4:.f, удале нием целевого компонента с пластин ки и фотометрированием 2J. Недостатком известного способа является недостаточно высокая эффективность разделения целевого и сопутствующих компонентов (степень разделения не выше 1,27). и относительно малая точность определения содержания витамина К. Целью изобретения является повы шение эффективности и точности спо соба . Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определе ния витамина К путем экстракции его из анализируемой пробы органическим растворителем с последующим хроматографированием экстракта на пластинке со слоем силикагеля, в подвижной фазе, содержащей гексан, удалением целевого компонента с пл тинки и фотометрированием, в качес ве органического растворителя испо зуют бензол, содержащий 1-2 об.% н-бутанола и использование в качес ве подвижной фазы гексан - хлорофо при объемном соотношении компонентов 46-52:54-А8. 12 На чертеже представлен калибровочный график для определения количества витамина К в экстракте из растительного материала. Определение витамина К проводят следующим образом. Навеску травяной муки вносят в пробирку с притертой пробкой, заливают 10 МП экстрагирующей смеси бензол, содержащий 1-2 об.% н-бутанола, и ставят в темное место на 3 ч. Далее содержимое пробирки пропускают через колонку диаметром 8-10 мм, заполненную силикагелем и безводным сульфатом натрия, а пробирку ополаскивают пятью порциями по 5 мл экстрагирующей смеси, которые также пропускают через колонку. Фильтрат выпаривают на роторном испарителе при 75-80°С и сухой остаток растворяют в 0,2 мл бензола. Затем, с помощью микропипетки, переносят количественно полученный раствор на пластинку Силуфол и по обе стороны от образца нано-; сят раствор - свидетель витамина К . Хроматографирование (восходящее) проводят в камере для тонкослойной хроматографии, насьш5енной парами подвижной фазы гексан - хлороформ, взятых в соотношении 46-52:5448 об.%. После того, как фронт растворителя дойдет до верхнего края пластинки, ее вынимают, просушивают и быстро определяют положение витамина К по свидетелю под ультрафиолетовой лампой - обнаруживается в виде темной полосы. Пятно силикагеля с адсорбированным витамином соскабливают с пластинки, переносят в пробирку с притертой пробкой, заливают 3 мл 96%-ного этилового спирта и ставят в темное место на 30 мин для элюирования витамина. Затем элюат отфильтровывают через бумажньш фильтр, смоченный этиловым спиртом, пробирку и фильтр ополаскивают 2 мл этанола. Далее фотометрируют элюат при длине волны 281 нм, переливают его в стеклянн5то центрифужную пробирку и облучают (сверху) лампой дневного света, расположенной на высоте 5 мм над пробиркой, в течение 7 ч. Затем повторно фотометрируют элюат при той же длине волны и по разнице показаний между первым и вторым измерениями определяют прирост экстинции.

Расчет содержания витамина К. в исследуемом образце проводят по формуле

(Е21 Ej) 000000 309100-А

где X - содержание витамина К в 1

травяной муки, мкгi оптическая плотность исследуемой пробы до облучения;

оптическая плотность исследуемой пробы после облучения ;

5 объем элюата витамина К после хроматографирования, мл, 1000000 - коэффициент пересчета г

в мкг;

309 - прирост Е, %; 100 - объем раствора, содержащего 1 г витамина К, мл, А - навеска исследуемого материала , г

Пример 1, Берут 500 мг. травяной муки, вносят навеску в пробирку с притертой пробкой, заливают 10 МП экстрагирующей смеси бензол, содержащий 2 об,% н-бутанола (к 10 мл бензола добавляют 0,2 мл н-бутанола) и хорошо перемешивают. Пробирку ставят в томное место на 2 ч. Заполняют колонку диаметром 10 мм слоем силикагеля (2 см) и сверху него насыпают 1 см безводного сульфата натрия. Содержимое пробирки пропускают через колонку, а пробирку ополаскивают пятью порциями по 5 мл экстрагирующей смеси, которые также пропускают через колонку. Фильтрат выпаривают на роторном испарителе при 80°С и сухой остаток растворяют в 0,2 мл бензола.

Затем с помощью микропипетки переносят полученный раствор (0,2 мп) на пластинку Силуфол, размером 15x15 см, и по обе стороны образовавшейся полосы наносят свидетельраствор - 5 мкг филлохинона в 0,1 МП хлороформа.

Развитие хроматограммы проводят в камере (180-70-170 мм), насьпценной в течение 30 мин парами смеси растворителей гексан - хлороформ, взятых в объемном соотношении 50:50. После того, как фронт подвижной фазы поднимется на высоту

15 см, пластину вынимают из камеры, просушивают и быстро определяют положение витамина К по свидетелю под ультрафиолетовой лампой (проявляется в виде темной полосы).

Пятно силикагеля с адсорбированным на нем витамином К соскабливают с пластинки, переносят в пробирку с притертой пробкой, заливают 3 мп

96%-ного этилового спирта и ставят в темное место на 30 мин. Затем отфильтровывают раствор через бумажный фильтр (красная полоса), смоченный этиловым спиртом, пробирку ополаскивают 2 мл этанола, который переносят на тот же фильтр. Далее фотометрируют фильтрат при длине волны 281 нм, переливают его в стеклянную центрифужную пробирку и облучают (сверху) лампой дневного света, расположенной на высоте 5 мм над пробиркой в течение 7 ч. Затем проводят повторное фотометрирование и по разнице показаний между первым и вторым измерениями определяют прирост экстинции и определяют количество витамина К, процент его извлечения и величины Кг сопутствующих компонентов. При этом количество витамина К, определяемое по калибровочному графику (чертеж), заключено в диапазоне 5-30 мкг (2-6 мкг/мл).

В предлагаемом способе определено содержание витамина К на уровне 16,8 мкг/г (при 100% извлечении) и величины Rr - для витамина К , равной 41, для /5 -каротина 87, 6 -токоферола 26, в то время как в

известном способе величины Rr равны 62, 79 и 38 соответственно. Степень разделения витамина К и сопутствующих ему компонентов составляет в предлагаемом способе 1,62,12, а в известном - 1,27-1,6.

Пример 2. Осуществляют определение витамина К, аналогично примеру 1, но в качестве подвижной фазы используют смесь гексанхлороформ, имеющую состав 46:54 об.% Результаты предоставлены в табл. 2.

Пример 3. Осуществляют определение витамина К, аналогично примеру 1, но подвижная фаза

гексан - хлороформ имеет состав 52-48 об.%. Результаты представлены в табл. 2.

Пример 4. Осуществляют определение витамина К, аналогично ipHwepy 1, с подвижной фаэой гекрйн - хлороформ, имеющей различный объемный состав. Результаты представлены в табл. 2. П р и м -е р 5. Осуществляют определение витамина К, аналогичн примеру 1, анализируя усредненный образец люцерновой муки, содержащи 19 мкг/г основного компонента. Параллельно проводятся анализы этого же образца по известному способу. Результаты экспериментов представлены в табл. 3. Данные табл. 1-3 свидетельствую о том, что оптимальньм соотношение гексана и хлороформа в подвижной фазе является интервал 45-52: :54-48 об.%. В этих пределах достигается наиболее точное определение витамина К в исследуемом обра це травяной муки и наилучшая эффек тивность разделения. В качестве экстрагентов витамина К из растиКомпоненты

Состав подвижной фазы, об. % тельного материала используется бензол в смеси с н-бутанолом. Сравнительный анализ выхода и определяемого количества витамина К из одного и того же образца при различном составе экстрагирующей смеси описывается следующим примером. Пример 6. Определение витамина К проводят, аналогично примеру 1, но в бензол добавляют 1,5 об.% н-бутанола. Результаты представлены в табл. 4. Таким образом, предлагаемый способ характеризуется повьшшнной эффективностью разделения витамина К и сопутствующих ему компонентов (степени разделения увеличивается на 25-32%), кроме того повьшается точность определения количества витамина К в образце (величина стандартного отклонения уменьшается от 3,8 до 0,05). Таблица 1

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА KY путем экстракции его из анализируемой пробы органическим растворителем, очисткой экстракта с последующим хроматографированием экстракта на пластинке со слоем силикагеля в подвижной фазе, содержащей гексан, удалением целевого компонента с пластинки и фотометотличающийрированием, с я тем, что, с целью повышения эффективности и точности способа, в качестве органического растворителя используют бензол, содерстсащий 1-2 об.% н-бутанола, и в качестg ве подвижной фазы используют гексан - хлороформ при объемном соотно-(Л шении компонентов 46-52:54-48.

Определено витамина К«7 97,9 97,6 99,7 99,8 ,. t А

Т а

лица 100 101 99,0 98,2 97,1 96 100 99,599,0 Бензол О 0,51,0 н-Бутанол Количество витамина 16,80 16,8617,43 % извлечения 94,6 96,6100,0

Таблиц-а 3 98,598,097,096,0 1,52,03,0 4,0 17,4117,4317,0816,92 99,9100,098,097,1

8 с, mijwi