Способ фракционирования нуклеиновых кислот бактерий Советский патент 1980 года по МПК C12D13/06 

(54) СПОСОБ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ БАКТЕРИЙ

Изобретение относится к биохимии, точнее к способу фракционирования нуклеиновых кислот бактерий для боле полного и точного учитывания количес венного содержания деэоксирибонуклеи новой (ДНК) и рибонуклеиновой (РНК) кислот бактерий. Известен способ фракционирования нуклеиновых кислот бактерий, предусматривающий удаление свободных нуклеотидов и липидов из клеток б ктёpий щелочной гидролиз клеток и клеточной РНК, осаждение ДНК и белков из гидролизата, отделение надосадочной жидкости, содержащей рибонуклеот ды от осадка 1. Однако этот способ - классический метод, 1Л идта-Таннхаузера не можёт, обеспечить полного и надежного разделения ДНК и РНК, и, следовательно не может быть использован для определения содержания ДНК у бактерий, так как он приводит к резкому занижению ее;содержания, в то время как результаты определения количества РНК завышены. Целью изобретения является более полное и точное разделение нуклеиновых кислот на фракции. Поставленная цель достигается тем, что надосадочную жидкость делят на две равные части, одну из которых обрабатывают этанолом для осаждения к ДНК, и осадок гидролизуют кислотой, после чего проводят количественное определение в полученных гидрсшизатах суммарной клеточной ДНК, а другую часть надосадочной жидкости гидролизуют и в полученном гидролизате определяют количественное содержание РНК. Сущность способа заключается в следующем. Определенную порцию фракции РНК нейтрализуют, концентрированным NaOH до рН 7,0, добавляют двойной объем холодного этанола (96°) и выдержиBaiS-ti ч при . Центрифугируют при 2-4°С в,течение 1 ч при 8000 об/мкн. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок, содержащий ДНК, подвергают кислотному гидролизу. В полученном гидролизате определяют количественное содержание ДНК. Общее содержание ДНК у бактерий определяется как сумма ДНК, получё ннрй после щелочного гидролиза, и ДНК, осажденной этанолом из фракции РНК.

Для доказательства, что осаждаемый этанолом из фракции РНК осадок содержит действительно ДНК, используют три независимых метода: спектрофотометрический, колориметрический и метод обработки специфическими нуклеазами. Спектрофотометрические исследования показали, что полученный осадок имеет характерный для нуклеиновых кислот УФ-спектр поглощения с максимумом при 260 им.

Полученный осадок дает резко положительную реакцию с дифениламином который специфически реагирует с дезоксирибозой.

Обработка осадка ДНК-азой привод к резкому изменению седиментационных пиков, получаемых при аналитическом центрифугировании, в то время как обработка РНК-азой характера пиков на седиментограмме практически не изменяет.

Специально проведенные исследования с использованием дифениламиновой реакции показывают, что количество ДНК, не поддающееся осаждению этанолом и остающееся во фракции РНК, не превышает 10-12%.

Пример . Культуру Е cod М выращивают на мясо- пептонном бульоне в течение 20 ч, 25 мл бульонной культуры переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при 2С в течение 15 мин при 3000 об/мин для осаждения клеток. Надосадочную жидкость отбрасывают. Для удаления остатков питательной среды осадок .клеток ресуспендируют в 15-20 мл, 0,15 М NaCI, центрифугируют при 2°С в течение 15 мин при 3000 об/ми Эту процедуру повторяют дважды, после чего удаляют кислоторастврримые нуклеотиды (строго при 2-4°С).

Отмытые от питательной среды клеки ресуспендируют в 10. мл холодной 3%-ной (НСС-Од , суспензию выдержи вают 15 мин, центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкости, сливают.

Процедуру повторяют до полного удаления кислоторастворимых нуклеот. дов. Степень удаления нуклеотидов контролируют путем спектр.офотометрирования надосадочной жидкости при 260 нм. Отсутствие поглощения свидете ьствует о,полном удалении кислот ораство 5имых нуклеотидов из клет осадок клеток после удаления кислоторастворимых нуклеотидов ресуспендируют. в 15 мл этанола, центрифугируют, при 3000 об/мин в течение 25 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Процедуру повторяют дважды (удаление липидов). Полученный осадок клеток, не содержащих кислоторастворимых нуклеотидов и липидов, ресуспендируют в 4 мл 0,5 н МаОН. Гидролиз проводят при 37°С

в течение 8-20 ч (щелочной гидролиз), отделяют щелочестабильную фракцию ДНК, для чего щелочной гидроли зат клеток охлаждают 30 мин в ледяной бане, добавляют до конечной концентрации 6-7% (на 4 мл щелочного гидролизата 4 мл 15%-ной НСРОд), выдерживают в ледяной бане 15 мин. В этих условиях согласно оригинальному методу ДНК выпадает в осадок. Осадок щелочностабильной фракции ДНК отделяют центрифугированием при 2°С в течение 30 мин при 6000 об/мин,

Надосадочную жидкость, представляющую собой смесь РНК и щелочелабиной фракции ДНК, сливают в чистую пробирку и проводят количественное определение щелочностабильной ДНК. Для этого осадок, содержащий щелочестабильную ДНК и неразрушенные щелочыо белки, ресуспендируют в 4 мл 6%-ной , , переносят в стеклянную пробирку, закрывают пробкой с каплеуловителем и 20 мин гидролизуют на кипящей водяной бане.

Затем кислотный гидролизат охлаждают, центрифугируют 20 мин при 3000 об/мин. Осадок отбрасывают, в надосадочной жидкости спектрофотометрически определяют содержание щелочестабильной ДНК путем измерения поглощения при 270 и 290 нм. .0,160; Е2доО,105.

Количество ДНК в пробе рассчитывают по формуле А.С. Спирина (1958)

(,1-p

Анк

0,19

где Сду,- количество ДНК в пробе, мк

.,- экстинкция раствора фракции при 270 нм;

290 экстинкция раствора фракции при 290 нм;

10,1- пересчетный коэффициент для ДНК;

0,19- разность между удельными экстинкциями при 270 и 290 нм;

Р - степень разведения; фракции .

Р . (0,-l60-o,i05V-fO, „ -.5Й9-И,69ллкг

Затем прово дят отделение щелочелабильной фракции ДНК,

Надосадочную жидкость после отделения осадка щел очестабильной ДНК (8 мл) ,. представляющую собой смесь РНК и,щелочел бильной фракции. ДНК, делят на две равные части. Одну часть (4 мл) используют для- количесвенного определения РНК, Другую часть (4 мл) нейтрализуют NaOH до рН 7,0 по лакмусу, добавляют двойной, объем холодного этанола (96, 8 мл) и выдерживают 1 ч при -6°С. При этом фрагменты щелочелабильной