Способ получения пуллулана Советский патент 1980 года по МПК C12D13/04 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПУЛЛУЛАНА Изобретение относится к микробиологической промышленности, а имегАо к получению полисахарида пуллулана путем аэробной микроб ной ферментации. Известен способ получения пуллулана путем выраижвания пуллулан-синтезирутощих микроор ганизмов в аэробныхусловиях в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, небольйше количества необходимых для роста питательных веществ, с последующим извлечением пуллулана из культуральной жидкости. Однако выход продукта в известном способе довольно низкий. С целью повьпиения выхода продукта предложено в качестве источника углерода применять крахмальный гидролизат, имеющий декстр ный эквивалент (ДЭ) 20-70, преимущественно 35-60. В этом случае крахмальный гидролизат состоит в основном из олигосахаридов. Целесообразно концентрацию подцерж1шать гидролизата в питательной среде 5 и 15 вес.%. Рекомендовано применять следующие микpoopraiDDMbi: PuMularia fermentans var.fermentans IFO 6401, Pullularia fermentans var. fusca IFO 6402, Pullularia pullulans AHU 9553, PuHularia piilfulans IPO 6353 или Dematiufn pullulans IFO 4464. Для ферментации пуллулана можно использовать крахмал, полученный из различных источников: кукурузы, пшеницы, картофеля и др. Если используемое сырье только частично состоит из крахмала, например рисовая мука, рисовые. отруби, овсяная крупа, его обрабатывают 0 амилазой при 50-70° С и отфильтровывают полученный водный раствор для удаления нерастворимого материала. Сироп гидролизованного крахмала, необходимый для ферментации, можно получить с помощью кислотного или ферментативного гидролиза. Гидролиз необходимо проводить таким образом, чтобы избежать образование продукта, имеющего ДЭ ниже 20, который может содержать непрореагировавший декстрин. Дггя проведения кислотного гидролиза к взвеси крахмала п воде добавляягг щавелевую или сачяную кислоту до pfi 2 или ниже, смесь выдер кивают при 120 С до тех пор, пока не получится требуемый ДЭ. Полученный раствор .охлаждают до комнатной температуры, нейтралгоуют карбонатом кальция и/или натрия, обесцвечивают активированным углем и очищают от посторонних ионов с помощью ионообменной смолы. Обесцвеченную жидкость можно использовать для приготовления питательной среды. Крахмальный гидролизат можно также полу чйть I обработкой только о; -амилазой или комби нацией кислотного и ферментативного гидролиза. Кислотный гадролиз и комбинации кислотного и ферментативного гадролиза обеспечивает получение крахмального сиропа, имеющего ДТЭ 50 или выше. ДЭ гидролиза, полученного только обработкой а-амилазы, не бьгоает вьппе 35.- - ,:; .; -,-., ,-.,.:,.:,- - - V Питательная среда должна содержать другие вещества, необходимые для роста микроорганиз мов, такие как органические шш неорганические источники азота, йеорганйчейкйе соли, например фосфат калия, натрий хлористый, маг кий сернокислый, железо сернокислое и т.д. Начальный рН культзфальной среды должен бьгть 5-7,5, температура ферментации 27-30°С. Самая высокая концентрация пуллулана оВьРшо достигается через 3-8 сут, когда в среде не остаетс, остаточного,сахара. Степень полимеризации пуллулана имеет тен дендаю к уменьшению с увеличеяиёй времени ферментации, поэтому если требуется продукт о высоким молекулярньш весом, ферментацию тферывают до достижения более высокого выхо да продукта. Аэрирование культуры осуществляют обычНЬ1М споробом. Условия аэрации не оказьшают осущественнрго влиянияна выход .. После окончания ферментации культуральйую ЖИДКОСТЬ прогревают, чтобы инактнвиро- вать содержащийся в ней фермент. Микробные клетки удаляют цёнтрифугарованием. К жидкости, освобожденной от клеток, до6авлян)Т метанол или другой органический растворитель, хорощо растворимый в воде и не растворяющий пуллулан, в количестве, доста-точном для осаждения пуллулана. Осажденный пуллулан извлекают из жидкости и очищают повторным растворением в воде и осаждением органическим pacтвopитeлe. Очищенный пуллулан представляет собой беловатый порощок, который очень легко растворяется в воде с образованием вязкого раствора. Средняя степень полимеризации пулЛулона, полученного данным способом, приблизительно 1000-3000.. Пример 1. Dematiom pullulans IFO4464 выращивают в среде, содержащей 10% источника углерода, 0,2% пептона, по 0,2% К2НРО4 и NaCI, 0,04% MgS04-7H20 и 0,001% FeSO4-7H20. В качестве источника углерода добавдяют глюкозу, сахарозу, мальтозу (ДЭ 60,5), кислотный гидролизат крахмала (ДЭ 45) и ферментативный гадролизат крахмала с ДЭ 40. Шчальный рН ере:дь17,5. Выращивание осуществляют в колбах емкостью 500 мл, содержащих 100 мл среды, на круговой качалке при в течение 7 сут. Пробы отбирают через ЗЗ и 7 сут и центрифугируют. К освобожденной от клеток культуральной жидкости добавляют 3 объема метанола для осаждения полисахарида, который очищают дважды растворением в небольщом количестве воды и переосаждением метанолом. Собранные осадки промывают метанолом, высушивают и взвешивают. Осадки идентифицированы как пуллулан гидролизом их пуллуланазой и бумажной хроматографией тидролизатов. Результаты представлены в табл. 1. Таблица I

-i;iii a-.™.i«ji- -y :-: w.Y:------ ---4а 4,80,81,5 5,8 3,2 0,5

4,2 4,20,71,4 5,11,2 0,3

4,2 4,60,97 2,0 6,5 3,1 0,5

21 32 43 30 45 54

32 61

10

4,2 4,4

Ферментативный гвдролизат крахмала (ДЭ 40)

4,2 4,2

Пример 2. Pullularia pullulans дни 9593и ферментативно до ДЭ 46 и крахмал, гилролизовыращивают в условиях, описагагых в гфимере 1,ванный кислотой до ДЭ 43. В табл. 2 приведена средах, содержащих глюкозу, сахарозу, мальтоэ 25нь1 значения остаточного сахара и выходы пулпукрахмал, гидролизованный в два этащ: кислотойлана на разных средах.

Источник углерода в среде

1 лгокоза

Сахароз а

Мальтоза,2,1

Крахмал, гидролизованный в два этапа (ДЭ 46)0,8

Крахмал, гидролизованный кислотой до ДЭ 43

Полученный пуллулан слегка окрашен. Пример 3. Pullularia pullulans ГР06353 выращивают в условиях и на средах, отсайных в примере 1, но длительность ферментащш 5 сут. Выходы 1 ллулана ниже, чем в примере 1, так как продолжительность фермектащш меньше, но на среде с гидролизатом крахмала пуллулана синтезировано на 25-30% больше, чем на среде с сахарозой или глюкозой. Пример 4. PuMularia pullulans var. fusca IFO 6402 выращивают в среде, описанной

5Д

13 0,1

38

75

67

1,8 5,1 2,0 0,335 65

72

Таблица2

Т

I Остаточный сахар

Выход пуллулаш. I г/100 мл

1,7

35

51

1,1

62

63

65

0,5 в примере I, содержащей 15% кислотного гидролизата крахмала с ДЭ 35. в качестве единственного источника углерода. После ферментации в течение 8 сут на хачалке при 27°С, когда в .среде не содержагтось остаточных Сахаров, фермент инактивируют прогреванием. Клетки удаляют, пуллулан осаждают из бесллеточной жидкости добавлением грех объемов метанола. Осадок отделяют и очищают повторным растворением в воде и перёосаждегшем метано пом. 10%-ный водный раствор очищенного пуллулана обрабатывают пуллуланазой, выделенной из культуральной жидкости Aerobacter, затем обесцвечивают активированным углем, очищают от -ионов ионообменной смолой и частично упариваю до получения бесцветного сигропа. По результатам хроматографичсского анализа и определения восстановительной способности продукт содержит чистую мальтотриозу. Выход мальтотриозы 95%. 30%-ный водный раствор мальтотриозы поме 1дают в автоклав с 0,30% карбоната кальция и 10% никеля Ренея, осажденного на твердых частицах, присутствующих в растворе. Мальтотриозу подвергают гидрированию при 100°С и давлении водорода 100 кг/см. Прогидрированную смесь профильтровьшают для удаления катализатора, фильтрат обесцвечивают и очищают от примесных ионов, как описано вьппе. Бесцветная жидкость не обладает восстанови тельной способностью и при гидролизе дает глюкозу и сорбит в молярном соотношении 2:1. . Таким образом, продукт пвдрирования мальтотрш ол. Получен из мальтотриозь с выхо дом 96%. Ь5иже приведена характеристика штаммов. Pullularia fermentans var.fermentans IFO 6401. Бластоспоры 3-4 на 7-10 мкм, хламидоспоры 13-15 мкм, артросноры 5-7 на 10-15 мкм, кладоспорные образования 9-17 мкм. Черные колонии с белым поверхностным миц лием на кукурузном агаре и агаре Сабурода. Пигмент образует только в аэробнь1Х услови периодически на среде Литтмана и не образует на питательном агаре. Воздушный мицелий образует периодически При 37° С не растет. Сбраживает глюкозу, маннозу, фруктозу, мал тозу, сахарозу и рафинозу. Pullularia ftrmentans var. fusca IFO 6402. Бластоспоры 3-4 на .11-13 мкм, хламидосшры 13-16 мкм, артроспоры 3-6 на 8-12 мкм, кладоспорные образования 4-6 на 14 мкм. Черные мукоидные колонии с черным поверхностным мицелием на кукурузном агаре, а ре Сабурода и Литтмана. Пигмент периодический в аназробных условиях, та питательном агаре отсутствует. Воздущный мицелий не образует. При 37t растет. Сбраживает гликсзу, мзннозу, фруктозу мальтозу, сахарозу, рафинозу и ксилозу. Кольц пслликлов были найдены в растворе. Pultularia pullulans АНИ 9593. Бластоспоры 3-4 на 7-11 мкм, хламидоспоры 14 мкм, артроспоры 3-4 на 7-10 мкм, к;|адоспорные образования 3-5 на 12-14 мкм. Маленькие черные колонии с зеленоваточерной поверхностью и воздушный мицелий на кукурузном агаре, агаре Сабурода и Литтмана. Пигмент образует только в анаэробных условиях. Растет при. 37С. Пелликлы в растворе были найдены со слабым осадком. Углеводы не сбраживает. Pullularia pullulans IFO 6353. Бластоспоры 3-4 на 7-11 мкм, хламидоспоры 14 мкм, артроспоры 3-4 на 7-10 мкм, кладоспорные образования 3-5 на 12-14 мкм. Маленькие черные колонии с зеленоваточерной поверхностью и воздушный мшделий на кукурузном агаре, агаре Сабурода и Литтмана. Пигмент образует только в аназробных условиях. Растет при 37°С. Пелликлы в растворе были найдены со слабым осадком. Углеводы не сбраживает. Dematium pullulans IFO 04464. Бластосноры 3-4 на 8-12 мкм, хламидоспоры 8-10 на 14-18 мкм, артроспоры 2-3 на 3-5 мкм. Маленькие черные колонии с зеленовато-черной поверхностью и воздущньш мицелий на кукурузном агаре, агаре Сабурода и Литтмана. Пигмент образует только в аназробных условиях. Растет при 37°С. Углеводы не сбраживает. Формула изобретения 1.Способ получения пуллулана путем выращивания пуллулан-синтезирующих микроорганизмов в азробных УСЛОВИЯХ в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим извлечением пуллулана из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повыщения выхода 1ч одукта, в качестве источника углерода применяют крахмальный гидролизат, имеющий декстрозный эквивалент 20-70, преимущественно 35-60. 2.Способ по П.1,отличающийся тем, что применяют крахмальный гидролизат, в основном состоящий из олигосахаридов. 3.Способ по П.1,отличающийся тем,что концентращию крахмального гидролизата в гштательной среде поддерживают в диапазоне 5-15 вес.%. . 4.Способ но Ш1.1 -3, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве пуллулан-синтезирующего микроорганизма применяют итгамм PuHularia fermentans var. fermentans IFO 6401.

9735177JO

6.Способ no пп.ЬЗ, отличающий- 8. Способ по пп. 1-3, о т л и ч a ю щ и и с я тем, что в качестве пуллулан-синтезирую-с я тем, что в качестве пуллулан-синтезирующего микроорганизма применяют штамм Pull и-щего микроорганизма применяют штамм Demalaria pullulans АНИ 9593.tiim pullulans IFO 4464.