Способ получения антибиотика Советский патент 1980 года по МПК C12D9/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности к производству антибиотиков. Способ получения антибиотики и-43,795, в патентной и специальной литературе не описан. Предложен способ получения нового антибиотика U-43,795, общей формулы м Н CH-CH-CD cNH} заключающийся в том, что культуру Streptomyces svlceus NRRZ5439 выращи вгцот в йодной питательной среде,содержащей источники углерода, азота или белковый материал с последующим выделением целевого продукта извест ными приемами. К углеродным источникам относятся глюкоза, коричневый сахар, сахароза, глицерин, крахмал, кукурузный крахмал,лактоза,декстрин,меласса;к источникам азота - жидкость nocjje замочки кукурузы,.црожжи,автолйзЬван ные пивоваренные дрожжи с,твердыми веществами молока,соевая,хлопковая И кукурузная мука, твердые вещества молока, продукт переваривания казеи на поджелудочной железой, барда. животные пептонные жидкости мясные и костяные отбросы. Преимущественно применяю сочетания этихуглерод- ных и азотных источников. Для инокуляции применяют вегетативную форму микроорганизма, а не егоспоры. Вегетативный прививочный материал получают путем инокуляции почвенной . культуры . o ivaceus NRRZ5439 в питательном бульоне и пересейа на скошенную среду. Молодой прививочный вегетативный материал в асептических условиях переносят в ферментер . Процесс ферментации проводят при 20-32 С, рН среды 5,5-7,0, оптимальное образование антибиотика наблюдается в течение .2-10 дней. Для выделения и очистки О-43,795 может быть применен ряд различных методов, например абсорбция с последующим элюированием растворителем, хроматография на колонке, частичная хроматография,, кристаллизация с выделением, из растворителя. Антибиотик и-43,795 выдеЪяют из культурапьной среды фильтрацией через диатомит (fW40). Прозрачную питательную среду фильтруют через хроматографическую

колонку, наполненную смолой сульФокислоты стиролового типа. Колонку . промывают, антибиотик элюируют основанием. Элюаты антибиотического действия смияивают и концентрируют.

Полученный водный концентрат фильтруют при нейтральном рН через , колонку, содержащую слабо основную Попиа|«1новую смолу стиролового типа Колонку промывгиот деиониэированной водой, 50%-ным водным метанолом, затем элюируют уксусной кислотой в 9%-ном метаноле.. Активные фракции элюата смешивают, затем упаривают досуха под пониженным давлением.

.Полученный остаток хроматографируют на силкк 1геле 60 в системе метилэтилкетбн-ацетон-вода (65:20:15).

ПолуЧШбт относительно чистый препарат антибиотика ,795.

В процессе выделения антибиотика проводят биоанализы с использованием 6acWus subtJttS lU.

П р и м е р. Ферментация.

Почвенный штамм бактерий Slreptomyce

sviceu WMRRZ5439 инокулируют в

колбах Эрленмейера {емкостью 500 мп со 100 мл .стерильной среды содержащей: 25 г/л декстрозы, 25 г/л Pharmamedic и до 1л водопроводной воды; рН среды до стерилизации 7,2. Приви1очный материал выращивают на протяжении 2 дней при 28 С на вращающейся виброустановке при 250 об/ми Полученным прививочным материалом инокулнруют в колбах Эрленмейера емкостью 500 мл 100 мл стерильной ферментационной среды следующего состава, г/л:

Углерод2

Крахмал кукуруз

: Пропитые дрожжи 2,5 Кау S оу . 20 Ферментационная среда также содержит 1 мл олеомаргарина из свинного сала и до 1 л водопроводной воды рН средл. перед стерилизацией доводят до 7,2 4Н гидроокисью натрия.

Ферментационные колбы инокулируют в соотношении 5 мл прививочного материала на 100 мл фермента

736875

ционной среды. Затем выращивают 2-3 дня при на вращающейся вибро-. установке при 250 об/мин.

Выделение. 250 л ферментационной среды фильтруют через диатомит средней пористости. Полученную прозрачную питательную среду пропускают через хроматографическую колонку, содержащую 25 л свежерегенерированного Dowex50 X 16 (H)V при рН 7-8. Колонку промывают 50 л деионизированной воды, злюируют 120 л 1Н , собиргиот 6 л фракционного материала. Активные Фракции смешивают и концентрируют под пониженным давлением для удаления избытки 5 .

Очистка, Колонка со слабо основной пол нами новой смолой стиролового типа,

0Активный водный концентрирован, ный элюат Doitiex 50, полученный опи«санным способом, рН 7-7,5 пропускают через колонку, содержащую 4 л Amber ilc JR. 45 (ОН) . Затем колонку промывают 8 л деионизироаанной воды, 4 л 50%-ного водного метанола и 8 л 90%-ного водного метанола. Собирают 2 л фракционного продукта. Наиболее активные фракции, определенные тестом subtitis , смешивают и упаривают досуха под;пониженным давлением.

Хроматография. При проведении этого процесса применяют силикагел15| 60, Реакцию осуществляют на остатках 3R54(OH), полученных описанным способом. Активные фракции, полученные из колонки 3R 45 упаривают досуха; уксусную кислоту вымывают водой. Полученный остаток суспендируют в 328 мл воды и упаривгиот до 33 г силикагеля. Колбу затем промывают 5 г свежего силикагеля, Гомогенный порошок хроматографируют на колонне с силикагелем, полученным суспен5 дированием 600 г,силикагеля в системе метилэтилкетон-ацетон и вода (65:20:15), Элюируют этой же смесью (7200 мл) собирая вначале 1200 мл и затем фракции 1-12 по 500 мл.

Результаты приведены в таблице.

Продолжение тае(лицы

30 57 70 70 60 55 47 32 О Наносят в виде капель разба виде капель на пластину с jljtl- В системе метилэтилкетон-ац пластине; Обнаружение нинги фракции 3 и 4 смешивают и ynajpHвают. под пониженным давлением при 40с, остаток растирают с метанолом. Получают 1,.37 .г чистого U-43,795. Перекристаллизацией из водного метанола получают аналитически чистый и-43,795 в виде его кристаллического гидрата. Воду можно удалить сушкой, Полученный антибиотик U -43,795 характеризуется следующими свойствами : ЯМР-спектр насыщенного растворе U-43,795 в )g О определяют спектрометром VariatiX Z 100-15 . Спектр 100 МГц ясно показывает наличие трех незаменяемых протонов. Метиновый протон у С-4 виден в. качестве кажущегося дублета при 5,34 с линей ным разделением 8,2 Гц, Соседний протон у С-5 виден в качестве кажущегося дублета дублетов, центрированных nfjH 5,19 с линейным разделе нием 3,4 Гц и 8,2 Гц. Сигнал метин аминокислоты представляет собой кажущийся дублет при 4,43 с линейным разделением 3,4 Гц, ИК-спектр ньюелевой растирки частичного гидрата U-43,795 опреде ляют спектрофотометром PerKin Efmer 421, Пики найдены при 3620, 3140, , 2620,. 1660, 1640,- 1610,. 1585 1525; 1385, 1325, 1310, 1270, 1255 1180, 1135, 1110, 1075, 580, 9i5 800, 865, 805 и 705 см,( 5h .-плечо Кольцевой дихроизм- О показывает в. воде/Q/ l + 60,000 и /п/МОКСл-1 ппп /W/2Q2 - 47,000,

U -43,795 и -43,795+АТ - 125 аТ-125

абая АТ-125 е фракции 1-10 агелем, да (65:20:15) на силикагелЬной ... При тех и -43,795 получают одну зону после опрыскйвания пластины раствором нингидрина.Пластины проявляют, в тетрагидрофуран-ацетон-вода (50:30:20), . Химическая структура U -43,795 в кристаллической форме установлена дифракцией {Зентгеновскими лучами: ptS , 45, 5R -(.-амино-3-хлор-4-окси-2-йзоксазолин-5-уксусная кислота. Мол, в, 212,59, Растворяется в воде и незначительно в метаноле, QTHOCH,тельнонерастворим в этилацетате, простом эфире, бензоле и хлороформе, Антибиотики -43,795, являясь амфотерным соедниением, образует соли с кислотами, щелочными металлами (включая аммиак), щелочноземельнымм металлами (включая магний Н алюминий) и аминами, и -43,795 поддается ациллированию с помощью соответствующего галлогенангидрида кислоты или ангидрида кислоты или сульфенилгалогенида, образуя соответствующее бис-ацильное производное, где 4-гидрокислый и А-амино-водород ациллированы, Антибиотик и, -43,795 активен, против Вас, Pis и Sarcmo fuiea , мышиной лейкемии типа 1210, Формула изобретения Способ получения антибиотика общей формулы н « СИ-СН -COg о отличающийся тем, что, культуру Strepfomyces swiceus NRRZ. 5439 выращивают на среде, содержа:.-.--- . ... ,. - щей источники ральиые сопи, иием целевого приемами. 73б875я ...... ..,.- . .; .-. , -о углерода, азота, мине-Источники информации с последующим выделе-принятые во внимание при экспертизе продукта известнымиiHutiHi-crobiq A e 9an«chemt)tberat)4 .03. 1973, vot 3, рТ 425-431.