Способ получения трипептидов Советский патент 1986 года по МПК C07K5/97 

см Изобретение относится к способу получения трипептидов общей формулы n-Glu-A,-А -NH-R где А - Ala, Gly, Val, Leu, Ser, Thr, Pro, Phe, lie, Pip, Tyr; A j- Arg, Lys; R - п-нитроанилид, новых биолохически активных соеди-. нений, содержащих хромофорную труппу, которые могут найти прим(гнение в биологии и медицине. Цель изобретения - новые производные пептидов, обладающие хромофорными свойствами и более высокой скоростью расщепления. При анализе элюатов и получаемых продуктов методом тонкослойной хроматографии в качестве адсорбционной среды используют стеклянные пластин с силикагелем F,,.. (Мегск) и хромато графирование осуществляют в следующих системах: А: н-бутанол:уксусная кислота:во да 3:2:1 (по объему); Р :хлороформ:метанол 9:1 (по объ ему) . После хроматографирования пласти ны просматривают в УФ-свете (254 нм а затем опрыскивают нингидрином и обрабатьдаают смесью дикарбоксидин/ ,/хлор. В тексте использованы следующие сокращения; НОАс уксусная кислота; Bz бензоил; СЬо карбобензокси; ДССЕ дициклогексилкарбодиимид; РСЕ j трех хлористый фосфор; ДМГ диметилформамид; EtjN триэтиламин; НОВТ 1-окси бензотриазол; ДСНА дициклогексиламин; ДСИ дициклогексилмочевина EtOH этанол; МеОН метанол; EtOAc этилацетат; OpNP п-нитрофенокси; pNA п-нитроанилид; TFA трифторуксус ная кислота. Пример 1. n-Glu-Gly-ArgpNAHCl (м.в.498,9); (м.с.,5) 175 мл концентрированной уксусной кислоты и 105 мл (5,6 моль) НВг в уксусной кислоте добавляют к 35 г (0,074 моль) CbO-Arg(NO)pNA и смес перемешивают в течение 30 мин до по лучения прозрачного раствора. Затем при интенсивном перемешивании полученный раствор выливают в 2 л сухог эфира. Образующийся осадок отфильтровывают и промывают сухим эфиром, высушивают в вакууме над NaOH. Полученную бромистоводородную соль H-Arg(NO,,)-pNA растворяют в 150 мл сухого перегнанного диметилформамида и нейтрализуют при низкой температуре () с помо1 1ью триэтиламина до получения с.чегка щелочной реакции на увлажненной реакционной смесью рН-индикаторной бумаге. Обычно на нейтрализацию расходуют Et,N в количестве, равном приблизительно 1,5 эквивалента НВг. Образующийся НВг отфильтровывают. При охлаждении к реакционной смеси добавляют 1,1 эквивалента 0,81 моль 26,8 г Cbo-Gly-OpNP; через 30 мин добавляют еще 1/2 эквивалента 5,2 моль Et N. Смесь оставляют при комнатной температуре на ночь. Затем упаривают в вакууме,полученное масло растирают в водном растворе 2%-ного NaHCO, затем растворяют в горячем метаноле и кристаллизуют при перемешивании и охлаждении. Об1эазующиеся кристаллы отфильтровывают и промывают холодным метанолом. Хроматография в тонком слое показывает наличие лишь незначительного количества примесей, продукт перекристаллизовывают из того же растворителя. Получают, белые кристаллы, представляющие собой согласно результатам тонкослойной хроматографии чистый продукт. Выход: 34 г (86%) (U); ,20 (Р,); CoLl -35,4° (С. 0,3 Метанол); IbCbo-p-GluOH (м.в.263,3). 56,3 г (0,20 моль) Cbo-Glu-OH растворяют в 400 мл этилацетата, добавляют 49,4 г (0,24 моль) дициклогексилкарбодиимида, растворенные в 60 МП этилацетата, и перемешивают i при охлаждении на ледяной бане. Через 2 ч образующуюся дициклогексилмочевину отфильтровывают и оставшийся раствор упаризают досуха. Продукт (ангидрид Cbo-Glu) кристаллизуют из этилацетата и петролейного эфира. Ангидрид растворяют в смеси i 20 мл диоксана и 260 мл эфира, а затем добавляют 48 мл дициклогексиламина (ДСНА), растворенные в эфире до объема 100 мл. Через некоторое время выпадает в осадок Cbo-p-Glu ДСНА. Смесь перемешивают приблизительно в течение часа, а затем образующуюся дициклогексиламмониевую соль отфильтровывают и промывают эфиром и этилацетатом, дициклогексиламмониевую соль суспендируют в этилацетате и взбалтьшают с 25 г (0,18 моль) KHSO, 31 растворенным в воде, образующийся в результате этого Cbo-p-GluOH переходит в этилацетатную фазу. Этилацетатную фазу промывают 10%-ным NaCl в воде и сушат над , . На этой стадии существует опасность вы падения продукта в .осадок. Этилацетатную фазу упаривают до небольшог-о объемаИ продукт осаждают петролейным эфиром, в результате образуются тяжелые кристаллы Ib, по данным ТС представляющие собой чистый продукт Выход: 36,9 г (80%) Ib ; ,45(A); 30,3 (С. 1 ,0 Ме та нол); IbCbo-p-Glu-Gly-Arg(NO, )pNA (м.в.641,6). 10,25 г (18,3 ммоль) H-Gly-Arg(N0/pNA HBr, полученного снятием защитных групп с Cbo-Gly-Arg /N02)pNa с помощью НВг согласно методу, описанному в 1а, растворяют в 35 мл сухого диметилформамида и нейтрализуют при низкой температуре () с помощью EtjN до получения щелочной реакции на увлажненной индикаторной бумаге. Образующийся EtNiHBr отфильт ровывают. К реакционной смеси добавляют 2,47 г (18,3 ммоль) оксибензотриазола и 5,26 г (20 ммоль) СЬо-р-Glu-OH (Ib) а затем при низкой температуре добавляют 4,53 г (22 ммоль) дициклогексилкарбодиимида, растворенных в небольшом количестве диметилформамида. Смесь оставляют на ночь при комнатной температуре , затем реакционный раствор упаривают и полученное масло растирают с 2% NaHCOj в воде и с чистой водой Образующееся твердое соединение раст воряют в небольшом количестве ацетона, а затем добавляют горячий метаНОЛ и небольшое количество воды. Про 4 дукт кристаллизуется при охлаждении и перемешивании, и образующиеся кристаллы отфильтровывают. Образующийся 1Ь представляет собой согласно результатам хроматографии в тонком слое чистый продукт. После тщательного высушивания в вакууме получают 8,90 г (76%) Ib. ,06 (R); 2,5ЧС.О,8 диметилформамид). 1,08 г (1,25 ммоль) 1Ь освобождают от защитных групп (деблокируют) с помощью 30 мл фтористоводородной кислоты при 0°С в течение часа в присутствии 0,6 мл анизола.После упаривания в вакууме продукт растворяют приблизительно в 30 мл 2%-ной уксусной кислоты и промывают небольшим количеством эфира. Водную фазу хроматографируют на колонке с Сафадексом G-15 (Фармация Фаин Кемикалз) в 2%-ной уксусной кислоте с той же средой для элюирования. Фракцию с чистым ацетатом 1 лиофилизируют и пропускают через колонку с ионообменной смолой Q АЕ-25 (Фармация Фаин Кемикалз) в хлоридной форме в смеси этанолгвода (1:1), и той же средой для элюирования. Фракцию с чистым гидрохлоридом I лиофилизируют. 485 мл (78%) 1 . Хроматография в тонком слое Rf показывает только одно у - 54,1 (С. 1,0, 50%-ная ксусная кислота/вода). Примеры II-XIII, описанные табл. I, осуществляют способом по римеру 1, физические константы, выоды указаны в табл. 1, условия проедения реакции сочетания и методы чистки указаны в табл. 2. Таблица 1

Изобретение касается пептидов, в частности получения трипептидов общей формулы 1 n-Glu-A; -A -NHR, где А ,- Ala, Gly, Val, Leu, Ser, Thr, Phe, He, Pip, Tyr, Pro; АЗ Arg,. Lye; R - п-нитроанилид, которые проявляют биологическую активность и могут быть использованы в биологии и медицине. Для выявления активности у соединений пептидного ряда были получены новые 1. Их синтез ведут из производного аминокислоты формулы А ,j, - NHR, где А и R имеют указанные значения и соответствующей аминокислоты с последующим наращиванием структуры до требуемого пептида с помощью сочетания остальных аминокислот, причем R используют в качестве защитной группы для С-концевой карбоксильной группы первой аминокислоты. Новые пептиды обладают хромоформными свойствами и более высокой скоростью расщепления при гидроСО лизе субстратов, чем известные, и могут быть использованы в качестве реагентов при определении сериновых и SH протеаз. 4 табл. to Г)

Obzl

На0,19Р,

N0;

Вос84

-24,9 95%-ные EtOH

Продо.пж15ние табл.

НОАс

Продолжение табл. 1

тон+МеОН

Продолжение табл.. 2

I 2 HF, анизол, QAE-25 95%-ный MeOH OpNP, крист. EtOAc+ HOBT, DCCl , крист. В№+ +EtOAc HF, анизол, G-15, 2%-ная HOAc 5 OpNP, крист. MeOH+H 0 HOBT, DCCl, крист. ацетон+МеОН+Н 020 HF, анизол, G-15, 2%-ная HOAc OpNP, крист. MeOH 25 HOBT DCCl, крист. MeOH+ HF, анизол, G-15, 2%-ная jo HOAc OpNP, крист. EtOAc-1-зфир HOBT, DCCl, крист. MeOH+ HBr/HOAc, QAE 25 50%-ный EtOH

Проведены испытания трипептидов общей формулы (I), полученных предлагаемым способом и определение протеаз с помощью субстратов с группами, подверженными отщеплению и-определению физико-химическими методами.

Субстраты, полученные.согласно приведенным примерам, могут быть использованы для определения различных энзимов следующим образом.

.. 3 основе определения лежит тот факт, что продукт расщепления,, образующийся в результате энзиматического гидролиза, имеет УФ-спек р, по существу отличный от УФ-спектра субстрата. Таким образом, все п-нитроанилидные субстраты по изобретению, например, характеризуются максимумом

277904

10 Продолжение табл. 2

1

поглощения при 310 ни с молярным коэффидиентом экстинкции примерно 12000. При 405 нм поглощение этих субстратов почти полностью исчезает „ п-Нитроанилид, который высвобождается из субстратов при энзиматичесхом гидролизе, имеет максимум поглощения при 380 нм и молярный коэффициент зкстинкции 13200, который при 405 нм снижается только до 9620. Поэтому с помощью снятия спектрофотометрических данных при 406 нм легко следить за количеством образующегося п-нитроанилида, которое пропорционально скорости знзиматического гидролиза, которая, в свою очередь, определяется количеством активного энзима. OpNP, крист. MeOH+H 0 HOBT, BCCl, крист. MeOH+ HBr/HOAc, QAE-25 50%-ный EtOH OpNP, крист. MeOH+H O HOBT, DCCl, крист. ацетон+МеОНHbr/HOAc, QAE-25, 50%-ный EtOH OpNP, MeOH+H,,0 HOBT, DCCl, ацетон+МеОН HF, анизол, QAE-25, 95%-ный MeOH OpNP, этилацетат+эфир HOBT, DCCl DMF- -этил ацетатHF, анизол, QAE 25 50%-ный EtOH OpNP MeOH+H 0 EtOH+H 0

1)127790412

В табл. 3 представлены значения каждого энзима скорость реакции рзяскоростей реакций синтетических суб- та относительно субстрата сравнения стратов с разлрмными энзимами. Для (скорость реакции 1).

Т а б л и ц а 3