Способ получения водорастворимых антигенов Советский патент 1980 года по МПК A61K35/34 

Изобретение относится к Области медицины, а ИМенно (К получению (препарата антдгенав миокарда, .которые iMoryT быть исоользава.ны в диагнюстичеаких целях для выявления, например, активности ревматиче окого працеоса и уточнения значения аутоиммунных 1механиз1МО1в IB развитии ретаматиама., . ,

Из1вбстен ani0ico6 получения водорасиво-. римых антигенов из Т1кави мио карда путем ее гомогенизации ic иоследующим центрифугированием 1г 01могената и выделением -целевого продукта.

Однако известный апособ не гарантирует высокую иммунологическую активность и чу1В|СТ|Вительность антигенов.

Целью изобретения Я1вляет1ся повышение Имм-унолопичеакой а:ктивно сти и чувствительности антигенов.

Это достигается тем, что ткань гОМоге низируют етри iSOOO-17000 об/мин в присутствии 0,,05 М Т(рис HCI буфера лри ipH 7,8-8,2, ;помогенат центрифугируют ступенчато от ЗгЭОО до 390QO об1мин, полученный осадок ресуспендируют,-обрабатывают тга1пйином (При .ооотношении его ж субстрату 1 : и выделяют целевой продукт хроматографичбски.

Кроме того, обработку папаином лроьодят в течение 60-вО мин. А для ресуапендиро(вания осадка и .хроматографии испо.льзуют 0,03-0,05 М Трис НС1 буфер.

Способ осуществляют следующим обраЗОМ.

5 Сердечную ткань, полученную от здоро-; йых лиц, погибших от случайных тра,в)м и взятую ,не пощнёе 4-6 ч .после Смерти, отХьшают от мрйви, отделяют миокард И гомогенизируют IB 1вих ре1вс1м смесите .те в 0,03-

10 0,05 М Трис НС1 буфере (рН 7,8-8,2) 1-1,5 мин при ШООО-20000 об/мин. Полученную .массу затем тгодвергают дробному центрифугированию при числе оборотов от 3000 до 30000 1В 1МИнут . Подученные вре15 зультате дробного центрифугир01вания клеточные мем(браны ресуапендируют в том же объеме буфера и переводят антиген в раст;вори1мое состояние об(работкой па.паином при соотношении фер|Мент : белок клеточных

20 мембран I : 5-1 : 25. Инкубацию с ферiMCHTOiM проводят 1 ч при 37° с. Добавляют иодащетат натрия до конечной концентрации 0,05 М для инажтивации дейст1вия папаина. Реакционную смесь ценТрифзгируют

25 1 ч при 37000 об/мин. Супернатант собирают, концентрируют и наносят на х;роматографичебкую колотаку с сефадексам G - 200 (2,5Х100). Оч1ищенный препарат собирают по 10мл. Всего было собрано 56 проб. Гель30 фильтрация ло3(воляет разделить материал

на три фраиции: А - с молекулярной массой не менее 2QOOOiO Дальтои (n.poi&Hpки 5-il6); Б -, с молекулярной маюсой 100000-35000 Дальтон (тробирки 17-36), 5-|фрак1ция - материал с имолекулярной маосой Менее 35000 Дальтон (пробирки 37-56). Все три фраиции жоицентрируют уль:11ра ф,ильт1ра цией ,на мемфанных фильтрах. СущеспБ-енно важньш для апогоба я)вляепся выбор Соотношения лаиаин : белок клеточных 1мем|бран.

Наилучшие результаты получены при соотношении фермента IK субстрату 1 : 1.5- 1 :30 и тампература реакции Э7°С. В этом случае pacTiBOipMMbm антигенный материал обладает навболышей активностью и почти целик;ам обнаруживается -во фраиции Б. Очищенный .Материал фракщии Б позволяет д:иа1гно1сти|равать скрыто- и вялотекущие ревматиЧбак;ие процессы (ревматизМ I степени активности). Для 1выя1вления активного рав.матичеокаго процесса -требуется всего одна единица продукта, IB то время, как в и-звестно-м Способе необхюджм.р не менее 20 единищ антигенноло адатариала.

Опоюоб поясняется следующкми примерами.

При/мер 1. Измельченную ножницами «а холоде (от -fil до +.2°С) ткань миокарда томогенизируют 1,5 мин при 13000 об1мин в 0,.03-0,05 М Трис НС1 буфера при рН 7,,2. Гамогенат (Центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, смпернатант .оо.бирают и центрифугируют 1,5 ч три 39000 об/мин (.Ii05000 g) на препаративной ультрацентрифуге.

Осадок (|клето1чные мембраны) ресуспендируют IB там же (буфере и обр.абаты1вают папаинам при соотнощении фермента к субстрату 1 : 25. Инкубащию с ферментом проводят 1 ч 1при 37°iC. До.бавляют иодацатат наприя до 1конечной конщенпращии 0,05 М для ина|Кти1ва1ции действия папаина. Реакционную смесь CHOsa центрифугируют 1 ч при .37000 об1Мин (88700 g) в там же роторе. Суиернатант собирают для дальнейшей очистки х|ро:матографией на колонке с сефадекоом G -200 (2,5X100 см). Пробы собирают по 10 мл. Bicero собрано 56 проб. Полученные фраздции клеточны с -мембран миокарда 1ко.н1цен 11рируют с по.мощью ультррафильЛрав на аппарате фкр.мы «Атгсоп Голла:ндия.

Антигенную активность полученных клеточных МвМ|бран ми1акарда опре.двтяют во всех 56 пробирках с помощью реакции торможения мигращии лейкоцитов ка1К у боЛьпых с клинически выраженным ревматическим лро Цбосо,м (II .степень активности) таК и у больных с мин1И1мальной активностью (ревматизма (I степень активности) с неактивной фазой ревматизма и в контрольной .группе. При оценке антигенной активности полученных клеточных -мембран миокарда берут различные концентрации

антигена ссодержв жем от лмг до 150 мк белка. Причем, у одноге) больного одновременно изучают все фржеции, т. е. антигены берут из- разных пробирок соответственно фракциям. В качестве контрольных антигенов иопользуют фраяЦионкрованные антигены печеночной ткани, экстракты почечной ткани, синовиальной ткани, скелетной мышцы, а также водно-солевые экстракты сердечной ткани.

Антигенная активность выявлялась в пробирках за номерами от 5 до 35 включительао, ада пробирках от 36-й до 56-й не выявлялось присутствие анти1гена. Причем, 5 для выявления активного ревматического процесса у больных с клинически ярко выраженной акти|вностью необходимо было б|рать не Менее мкг белка из пробирок с 5-й по .15-ую и 1-2 мкг белка из про0 бирок 17-Э5. Для выявления же активного процесса у больных с минимальной степенью aiKTHiBHOCTH необходимо было брать 2 5-150 мкг белка из пробирок 5-15 и 3-5 мкг белка из пробирОК с 17 по 35. 5 Таким об|разом, активньши в антигенном отношении оказались фрак1ции А (пробирки ) и Б (пробирки 17-35). Фракция В оказалась неактивной, т. е. состоящей из балластных белков я не содержащей антигенного Материала. Самой активной фракцией оказалась Б фракщия. Для выявления даже минимальной активности ревматизма необходимо всего 3-б мкг бел. этой фракции, тогда как фракция А, по-видимаму, за5 грязнена другими белками Мембран и поэтому в реа|К цию необходимо брать большее К оличест1во .материала (25-50 мкг белка). Пример 2. Вое процедуры проделывают, как в примере 1, но соотношение фер0 мента папаина к белку клеточных мембран берут 1 :5.

Антигенная активность клеточных мембран миокарда обнаружявалась как во фракции А, так и во фракщии Б, но только 5 у больны.х с .Я|рко выраженной акти1вностьк ревматического процесса. У больных с минимальной а11сти1вностью ревм атичеокогопроцесса работала толыко фрамция Б, но с большей ковцентр-ащией антигена, чем в 50 примере 1 (10-il5 мкг.

Таким образоМ, при соотнощении фермента напаина к белку клеточных мембран 1 :5 происходит р-азрушение ферментом активного материала, следовательно, в дан-; 55 ном случае было кзято фермента IB избытке и часть антигенов разрущилась, лоэтоМу ВЫХОД антигенного материала оказался небольшим.

Примерз. Все процедуры получения 60 водорастворимых антигенов миокарда проводятся, как в первых двух примерах, но соотношениефермента папаина к белку клеточных , берут 1 ; 15.

(При данных услсвиях выделения анти65 генов миокарда антигенная активность наиболее (выражена во фракции J5 клеточных мембран миокарда. Меньшая активгНОСТь антвгена отмечена во фракции А, фраюция В - неактивна. У больных, с минимальной степенью а.кти1вности (I степень) для выявлекия ревматического wpoiuecca достаточно было антигена клеточных мембран миокарда с концентрацией белка из фракции Л от 2 мкг до 10 мкг, а в Б фракции oicero 1-12 мкг белка. У больных с выраженным ревматическим процессом (II степень активности) для диа1гнасти1К1И достаточно было 1 мкг антигена фракции А, а фракции Б - 1 мкг и менее.

Исходя из вышеописанных данных весь материал, полученный после очистки ,на сефадек1се G - 200 объединяют -в тр;И фракции: фракция А с поряякавЫМ но-мером пробирок от 5 до 15 .включительно, фракция Б - про-бирки с ;порядковы1ми номерами от 17 до 35 включительно, и фракция В - лро ир«|И с паряда-авьими номера1МИ от 37 до 56.

Полученные водорастворимые фр:акции клеточных миокарда исследовали IB реакции торможения .миграции лейкацитав у 300 человек, из которых 150 были больны рааматизмам, 150 составляли контрольную (Лруцпу. В контрольной группе торможение мишрации лейкоц:ито1в -на антигены клеточных мем1бран -миокарда не отмечалось. Индекс Миграции лейкоцитов у здоровых лиц составлял не менее 96%. У остальных лиц контрольной группы (людей с други1ми за1болевания ми) средняя веЛИ1Чина индвноа миграции лейкоцитов была также выше 80% (от 91 до 135%).

У больных акти1вны1М ревматизмом отмечалось отчетливое торможение миграции лей(коцито(в, оно было гораздо более выраженным, чам 1При использовании водно-солевых экстрактов миокарда. Средняя величина индекса миграции лейкоцитов у больных активным ревматизмом при использовании од.инаковы,х концентраций антигенов, но разных фракций дает (следующие результаты: фрак/ция А составляла 35-49%, фракция Б - 20-33%, а фракция В 94-Ш2%. Следовательно, наибольшее торможевие м,И1Прации лейкоцитов, т. е. наилучший результат, аают антигены, взятые из

фракции Б.

Предлагаемый способ гарантирует высокую иммунологическую активность и чувст|вительнасть антигенов, что (позволяет улучшить диагноспику за болевания, а также 1воз1можность обнаружения скрытых и вялотекуших фор.м сердечных заболеваний.

Формула изобретения

1.Опособ йолучения водорастворимых антигенов из ткани миокарда лутем ее гомогенизации 1C последующи м центрифугированием гомогената и выделением целевого цродукта, отличающийся тем, что, с целью повышения им1мунологической активности и чувствительности антигенов, ткань гомогенизируют цри 13000-17000 об/мин в присутствии 0,03-0,05 М ТрИС НС1 буфера при рН 7,8-8,2, 1гомогенат центрифугируют ступенчато от 3000 до 39000 об/мин, (полученный осадок ресуспендируют, обрабатывают (папаином (при соотношении его к субстрату 1 : 10-15 и выделяют целевой продукт хроМ|ато:лра(фичеаки.

2.Способ ПО ;п. 1, отличающийся тем, что обра ботку палаином проводят в течен1ие мин.

3.Опособ (ПО ц. 1, отличающийся тем, что для ресуОпендирования осадка и

хроматографии используют 0,03- 0,05 М Трис НС1 буфер.