Способ выращивания Советский патент 1980 года по МПК C12K1/00 

(54) СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ BACILLUS ТНИКШОШМЗТЗ Изобретение относится к области микробиологического синтеза с использованием продуцентов, обладающих способностью ко вторичному метаболизму, в результате которого получаются токсины, и может быть использовано в микробиологической промытленности. Известно, что вирулентность некоторых энтомопатогенных препаратов, в частности эитобзктерина, связана с токсинообразованием продуцента 1. При выращивании микроорганизмов, синтезирующих инсектицидные токсины, большое значение имеет регулирование метаболических механизмов, которое для получения максимальных выходов продуктов может быть связано с нарушением роста клетки или ее метаболизма. При этом условия, важные для получения максимальной массы клеток, обычно не совпадают с теми, которые обеспечивают максимальный выход продукта метаболизма-токсина. В частности известно, что состав питательной среды, а также соотношение различных компонентов питательной среды влияет на выработку токсинов микроорганизмами 2 VAR. GALLERIAE Однако каких-либо конкретных соотнощений различных компонентов питательной среды, влияющих на биосинтез токсинов, в известных выше источниках не приведено. Наиболее, распространенными компонентами, используемыми в промышленных производствах, являйтся кукурузный экстракт, кормовые дрожжи, рыбная мука - как источник азотистых веществ, и глюкоза, крахмал,кукурузная мука - как источник и углеводов. Выбор количественных соотношений и концентраций этих компонентов направлен на получение максимального выхода продуктов вторичного метаболизма - токсинов. Известен промышленный способ выращивания аэробных токсинообразующих энтомопатогенных микроорганизмов Вас. thurihgiensis var. galleriae на жидкой питательной среде, содержащей сахара (700900 мг°/о в пересчете на глюкозу) и аминокислоты (45-75 мг% аминного азота) на 1 л среды, причем питательная среда такого состава стиммулирует усовия спорогенеза и кристаообразования в микроорганизмах за счет лимитизации процесса по caxapalM |3j.

В результате спорообразования и кристаллообразования формируется инсектицидность препарата. По окончании ферментации среда оказывается истощенной по сахарам (содержание Сахаров составляет 50 мг% в пересчете на гл1бкозу), но она содержит 5 значительные количества аминокислот (содержание аминного азота составляет 3060 мг%).;

Недостатком этого способа выращивания микроорганизмов является низкая токсичность получаемого препарата и нецелесообразный расход дорогостоящего сырья, содержащего аминокислоты.

Целью изобретения является увеличение активности получаемого энтобактерина при «5 одновременном сокращении затрат на его получение: сокращаются затраты на сырье, содержащее аминокислоты при производстве инсектицидных препаратов с использованием Вас. thuringiensis var galleriae.

Указанная цель достигается тем, что выращивание этого микроорганизма проводят в условиях лимитизации среды по азоту, а также тем, что микроорганизмы выращивают на питательной среде, содержащей угле- js водов 700-1200 мг°/о (в пересчете на глюкозу) и 15-30 мг°/о аминного азота на 1 л среды.

Лимитизацию среды по азоту можно достигнуть различными путями: уменьщением в исходной питательной среде содержания в компонента, являющегося источником амино кислот при периодических пересевах; дробной подачей или поддержанием определенного лимитирующего уровня азота в периодических лелевых процессах. При этом ,. механизм метаболизма, регулирующий синтез токсинов, переключается на увеличение выхода вторичных метаболитов - токсинов.

В приведенную ниже таблицу сведены результаты лабораторной проверки предлагаемого способа в сопоставлении с прототипом, 40 показывающие увеличение степени токсичности (уменьщение летальной концентрации культуральной жидкости для биологического тест-объекта) при условиях лимитации процесса по аминному азоту.

Проверка проводилась на способе пери- Ьдического культивирования продуцента Bacillus thuringiensis на питательных средах различного состава.

Токсичность оценивалась по тест-объекту гусениц Вас.galleriae mellanela.50

Как видно из приведенных в таблице Данных, культурная жидкость, получаемая на средах, объединенных по аминному азоту, имеет токсичность в 3-5 раз выще, чем на средах, стимулирующих лимитацию процесса по сахарам. Причем по известному способу имеется избыток аминного азота в конце ферментации, а по предлагаемому способу к концу ферментации аминный азот исчерпан до нуля.

Пример 1. Питательная среда, содержащая кукурузный экстракт (15 мг% аминного азота) и глюкозу (700 глюкозы), приготовленная на водопроводной воде, имела рН среды 7,3 ед; была простерилизована при 0,7 ати 20 мин и разлита в колбы по 40 мл. Засев производили водной суспензией спор культуры Вас. thuringiensis van galleriae щтамм № 69/6. Колбы помещались на круговую качалку с числом оборотов 350 мин при 30°С.

Процесс выращивания продолжался 30 час. В конце ферментации при спорообразовании на 90% титр спор составлял около культуральной жидкости. Токсичность культуральной жидкости, выраженная в Лк 50 , определяемая по ТУ59-61-74 производства энтобактрина, составляла 0,9%

Пример 2. Вьфащивание Вас. thuringiensis проводили в условиях, аналогичных приведенным в примере 1, на питательной среде, содержащей кормовые дрожжи (25 мг% аминного азота) и кукурузную муку (800 мг°/о глюкозы). Титр и токсичность культуральной жидкости составляли соответственно l, и Лк5о -0,7%.

Осуществление предлагаемого способа позволит при меньщих затратах увеличить токсичность получаемой культуральной жидкости в 3-5 раз и токсичность получаемых на ее основе сухого или жидкого препаратов. При принятом в настоящее время эталоне токсичности, например в производстве энтобактерина, увеличение токсичности получаемой культуральной жидкости при сохранении того же уровня производительности аппаратов (ферментаторов) позволит увеличить выход готового препарата за счет боьщего разбавления его наполнителем.

Одновременно при этом снижается расход дорогостоящего сырья, содержащего аминокислоты, например кукурузного экстракта в 4,8 раза, а кормовых дрожжей в 3 раза, что означает снижение себестоимости готовой продукции только за счет этой статьи расходов (затраты на сырье) на 25%.

Результаты лабораторной проверки предлагаемого способа по сравнению со способом-прототипом