Способ определения антивируснойАКТиВНОСТи ХиМичЕСКиХ ВЕщЕСТВ Советский патент 1981 года по МПК C12K1/00 

Изобретение относится к микробиологии и может найти применение в фармацевтической промьппленности для изыскания средств, обладающих противо вирусной активностью. Известен способ определения антивирусной активности химических веществ путем заражения лабораторных животных вирусом и введения исследуемого вещества с последующей оценкой результатов Г13 Недостатками известного способа определения антивирусной активности препаратов являются длительность (42 дня) и высокая стоимость эксперимента, связанная с большим расходом животных, так как для оценки эффектив ности одного препарата необходимо I20 мышей. Способ очень трудоемок требует ежедневного двухкратного введения препарата больши группам животных в течение 5 дней и обеспечивает низку чувствительность вследствие применения в качестве энтеровирусной модели NftunHHoro вируса энцефаломиокардита. Действие исследуемого препарата на мышиный вирус энцефаломиокардита может быть не идентично его действию на энтеровирусы человека. Целью изобретения является повьшение чувствительности способа и упрощение его. Цель достигается тем, что животных заражают светочувствительным вакционньм штаммом полиовируса человека, выращенного в культуре клеток в присутствии профпавина, и по наличию светорезистентного потомства исходного вируса в тканях инфицированного животного определяют антивирусную активность. В качестве лабораторных животных используют новорожденных хлопковых крыс. Способ осуществляют следующим образом. Приготавливают рабочий вирус. Фотосенсибилизацию полиовируса производят путем 3-4 серийных пассажей в культуре клетик в присутствии 2,5 мкг про-флавина на 1 мл поддерживающей среды. В качестве исходных штаммов полйовируса может быть взят любой из трех вакцинных штаммов (LSC2ab, Р712, Ch2ab, Leonl2ab) полиовируса I, TI, 111 типа. Пассажи вируса с профлавином проводят в первичной культуре клеток почки обезьяны или в любой перевиваемой культуре клеток (Не1а, ), восприимчивой к полиовирусной инфекции. После удаления среды роста в пробирки с монослойной культурой клет:ок наливают по 1,5 мл поддерживающей среды с профлавином. Пробирки инкубируют во вращающемся барабане 30-60 мин при 36-37С и затем обертывают фольгой. Затемненные пробирки заражают штаммом полиовируса в количестве 10-10 БОЕ/0,1 мл и помещают в барабан при ,. На сле дующий др.нь из барабана берут 2-3 зараженные пробирки, снимают с них фояь гу и просматривают под микроскопом. Эти же пробирки, уже больше не покрывая их фольгой, используют для дальнейшего наблюдения за развитием цитопатического эффекта. При наступлении вирусной дегенерации в пробирках находящихся под наблюдением, эти пробирки выбрасывают. Остальные, находящиеся в барабане зараженные пробирки вынимают завернутыми в фольгу и замораживают. После оттаивания культурал ную жидкость сливают во фпакон, обер нутый фольгой, и используют для последующего пассажа вируса с профлавином. Все процедуры с вирусом (слив, за ражение) проводят при сумеречном осв После 3-4 пассажей с профлавином культуральную жидкость титруют методом бляшек. Параллельно проводят тит рование необлученного вируса при сумеречном освещении и титрование пред варительно облученной порции того же вируса - при обычном освещении. Для облучения берут небольшое количество (0,5-0,7 мл) культуралъной жидкости из общего пула вируса и выдерживают 15-20 мин под лампой дневного света при 4000 люкс. Титр необлученного ви руса при титровании в темноте должен быть БОЕ/МЛ, титр того же вируса после об::учения должен быть н более 10 -10 БОЕ/мл. Такой пул вируса с высоким содержанием светочув753142ствительных вирусных частиц и с низким содержанием или отсутствием светорезистентных вирусных частиц является пригодным для проведения экспериментов на животных. Вирус разливают по 1,0-2,0 мл в инсулиновые флаконы, обернутые в фольгу, и хранят при . Приготовленный рабочий вирус может быть использован в течение двух лет. Эксперименты на животных. Светочувствительный вирус в количестве в объеме 0,1 мл вводят подкожно 30-50 xлo кoвым крысам в возрасте 2-3 дней. Половина животных (15-25 крыс) дополнительно к вирусу получает 3-4 инъекции исследуемого препарата. Препарат в субтоксической дозе вводят крысам подкожно в дозе 0,1 мл за сутки до заражения, в день введения вируса и в течение 1-2 дней после введения вируса. Другая - контрольная группа животных (15-25 крыс) в дополнение к вирусу получает не препарат, а только -растворитель препарата в тех же объемах. Через 2 ч после заражения и затем ежедневно в течение 4 дней производят забой по 3-5 сосунков хлопковых крыс из группы животных, получавншх только вирус, и по 3-5 сосунков из группы животных, получавщих вирус и препарат. Из забитых крыс готовят 10%-ные тушкоВомозговые суспензии. Суспензии во (флаконах, обернутых в фольгу, замораживают, оттаивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость титруют в темноте и параллельно после облучения лампой дневного света. В контрольной животных, которая получала . только светочувствительный вирус, происходит размножение этого вируса, протекающее без клинических симптомов заболевания и выражающееся в образовании светорезистентного вирусного потомства в титре до 10 -10 БОЕ на 1 мл суспензии. 1 Б группе животных, получавших светочувствительный полиовирус и препарат, вызывающие подавление размножения вируса, светорезистентного вирусного потомства не будет, и титр светорезистентного вируса будет оставаться на нуле в .течение всего периода наблюдения . У этой группы животных можно проследить только постепенное падение титра введенного светочувствительного вируса. Если препарат не ока эывает антивирусного действия, нотных, получавших этот препарат, также как и у животных контрольной груп пы, происходит образование светорезистентной популяции полиовируса до .мл. Определение эффективности препарата, включая эксперименты на животных, приготовление суспензий и титрование вируса методом бляшек продолжается 8-12 дней. Предлагаемый способ позволяет значительно увеличить точность и воспроизводимости результатов испытания противоэнтеровирусной активности химических веществ, так как определение титР ч вируса в контрольной и опытной группах животных проводится очень точным методом бляшек, а не по выживанию зараженных животных. Кроме того, при использовании предлагаемого метода в одном опыте получаются статистически значимые результаты и нет нужды в повторении опытов, которое часто необходимо недостаточной точности и низкой воспроизводимости опытов, основаных на выживании животных. Предлагаемый способ позволяет значительно сократить сроки оценки активности препарата с 42- до 8-12 дней. Предлагаемый способ дешевле, так как требует 30-50 сосунков хлопковых крыс для оценки одного препарата в отличие от существующего способа, который требует 120 взрослых белых . Расход сосунков хлопковых к{ияс может быть сокращен при проведении оценки одновременно нескольких препаратов, поскольку группа животных (15-25 сосунков), получающая только вирус, может служить контролем одновременно для нескольких групп животных (по 15-20 сосунков). 75 то у жи 2 получающих как вирус, так и испытуемый препарат. Предлагаемый способ позволяет вести отбор препаратов, обладающих антивирусным действием, непосредственно против знтеровируса человека, а именно против полиовируса, а не против мышиного энтеровируса - вируса энцефаломкокардита. Предлагаемый способ, основанный на использовании вакционных штаммов по- лиовируса, безопасен для людей и доступен для работы во всех энтеровирусных лабораториях. Формула изобретения 1. Способ определения антивирусной активности химических веществ путем заражения лабораторных животных вирусом и введения исследуемого вещества с последующей оценкой результатов, отличающийся тем, что, с целью повыщения чувствительности способа и упрощения его, животных заражают светочувствительным вакционным штаммом полиовируса человека, выращенного в культуре клеток в присутствии профлавина, и по наличию светорезистентного потомства исходного вируса в тканях ин кшированного животного определяю антивирусную активность. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, в качестве лабораторных животных используют иоворожденных хлопковых крыс. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. J. Chemotherapy, 1974, 20, р. 235-244.