4-Диметиламинопиридиниевые соли @ -защищенных аминокислот в качестве промежуточных продуктов для синтеза пептидов Советский патент 1986 года по МПК C07D213/18 

1

Изобретение относится к новым химическим соединениям пиридинового ряда, а именно к 4-диметиламинопи- ридиниевым (ДМАП) солям N-защищенных аминокислот, которые являются проме- жуточными продуктами в синтезе пептидов.

Целью изобретения является поиск в ряду пиридина новых соединений, являющихся более удобными в работе промежуточными продуктами для синтеза пептидов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Общая методика ДМАП солей S-защищенных аминокислот (О -нитрофенилсульфенилфенилала- нина (Нфс-фенилаланина), о-нитро- фенилсульфенилвалина (Нфс-валина),

трет -бутоксикарбонилвалина (Бок-вали- 20 аминокислотного анализа содержит

на) . Аминокислоты обла,цают L -конфигурацией .

Около 12 ммоль дициклогексиламмо- ниевой (ДЦГА) соли Нфс-аминокислоты суспендируют в смеси, состоящей из 40 мл этилацетата и 40 мл 0,5 М водного раствора серной кислоты и охлажденной до . Взбалтывают до растворения ДЦГА соли (5-10 мин). Если при этом выпадает желтоватый осадок, состоящий в основном из 0,0 -динитро- дифенилдисуль да и мешаилций расслоI

ен1бю фаз, его отфильтровьгеают. Желты этилацетатный слой промывают водой (3 X 30 мл), сушат добавлением безводного сульфата натрия и растворитель упаривают в вакууме до постоянного веса остатка, являющегося Нфс- аминокислотой.

Аналогично из ДЦГА соли Бок-валина 40 желтых побочных продуктов проводят

выделяют свободный Бок-валин.

Полученную таким образом Н-защи- щенную аминокислоту (около 10 ммоль) растворяют в 20 мл сухого диоксана или диметилформамида (ДМФ) (в случае производных аспарагина и глутамина), охлаждакгг (до 10 С) и добавляют эквивалентное количество 0,3 М раствора ДКАЛ в том же органическом растворителе. Растворитель упаривают в ва- кууме до четверти начального объема и остаток кристаллизуют добавлением петролейного эфира. Полученные кристаллы отфильтровывают, промьшают пётролейным эфиром, ввдерживают в вытяжном шкафу до воздушно-сухого состояния, потом - в эксикаторе под вакуумом до постоянного веса.

Выходы и характеристика полученных соединений приведены в табл. 1.

Пример 2. Применение ДМАП солей НФС-аминокислот для присоединения НФС-аминокислот к хлорметили- рованному полимерному носителю Нфс- -фенилаланил-полимер.

Используют хлорметилированный полистирол 1%-ной сшивки емкостью 0,87 мэкв/г и размерами гранул от 200 до 400 меш. Указанный полимер (1 г) суспендируют в 7 мл ДМФ, добавляют 0,44 г (1 ммоль) ДМАП соли Нфс-фенилаланина. Смесь медленно перемешивают 7 ч при 50 С. Полимер последовательно промывают 3 X 30 мл , ДМФ, воды, этанола и эфира. В итоге получают 1,08 г Нфс-фенилаланил- полимера, который согласно данным

0,24 мэкв/г фенилаланина.

Пример 3. Синтез амида тет- рапептида Tyr-Pro-Phe-Pro-NH (мор- фисептина) с использованием ДМАП солей НФС-аминокислот.

1 г НФС-пропил-полимера, полученного аналогично примеру 2, помещают в реакционный сосуд синтезатора пептидов модели 990 В фирмы Бекман и согласно программе (табл. 2) проводят наращивание пептидной цепи кар- бодиимидным методом с использованием ДМАЛ солей НФС-аминокислот (фенилаланина, пролина, тирозина).

НФС-группу удаляют трифторуксус- ной кислотой аналогично удалению Бок-группы, но сократив время обра-. ботки кислотой до 4-5 мин. После отщепления НФС-группы и отмывания

нейтрализацию триэтиламином, добавляют ДМАП соль НФС-аминокислоты и N,N-дициклогексилкарбодиимид и (ДЦГК). Берется обычный 2,5-3-кратный избыток карбоксильного компонента и конденсирующего реагента. Кон- денсацию проводят однократно, блокировку непрореагировавших аминогрупп не осуществляют. Последнюю Нфс-груп- пу (у остатка тирозина) также отщепляют в синтезаторе. После этого полимер при периодическом взбалтывании выдерживают 3 сут при комнат- ной температуре в 5 М растворе аммиака в метаноле.

Растворитель упаривают, амид пептида извлекают из полимерного носителя 1%-ным раствором уксусной кислоты и полученный раствор частично упаривают, потом лиофилизуют. Выход неочищенного твердофазного морфи- септина 0,11 г.

,Морфисептин очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией (прибор фирмы Дюпон модели 830, колонка Зорбакс С размером 4,6 х X 150 мм, элюент 1 7%-ный ацетонитрил + 83% 0,1 М раствор ацетата аммония) . Из основной фрак1хии после лио филизации получают 10 мг электро- фрретически однородного ацетата мор фисептина (8,6% из расчета на Нфс- -пролил-полимер). Аминокислотный анализ: тирозин 1,0, пролин 2,2, фенилаланин 0,9, Нингидриновая реакция и реакция Паули положительны. Согласно радиорецеп- торному анализу синтезированный морфисептин, как и ожидалось, является селективным лигандом опиатных Ji - рецепторов мозга :крыс, а со- рецепторами мозга крыс практически не взаимодействует.

ДМАПНфс-фенил В теплой, 40-50°С, воде.

10

2539754

Пример 4. Синтез п -нитро- бензилового эфира Бок-валил-о-бен- зилтирозина.

К раствору 3,4 г (10 ммоль) ДМАП

5 соли Бок-валина в 15 мп ДФМ при

добавляют раствор 4,4 г (10ммоль)

гидрохлорида h-нитробензилового эфира о-бензилтирозина в 15 мл ДМФ, 1,72 мл (10 ммоль) К-этилдиизопро- пнламина и 2,3 г (11 ммоль) ДЦГК, Смесь оставляют при комнатной температуре 17 ч. Упаривают ДМФ и остаток растворяют в этилацетате. После обычных «ромывок, упаривания, кристаллизации, растиранием эфиром и сушки получают 5,7 г (94%) хроматографичес- ки чистого дипептида.

Программа для автоматического твердофазного синтеза морфисептина с использованием ДМАП солей НФС-аминокислот состоит из циклов: отщепление НФС-группы и удлинение пептидной цепи на один аминокислотный остаток. Загрузка - 1 г Нфс-пролил-полимера, емкость 0,2-0,25 мэкв/г, время перемешивания при каждой обработке(за исключением стадии конденсации) 2 мин,

Таблица 1

Т5

20

23

Промьшание дихлорметано

(ДХМ)

Отщепление Нфс-группы 30%-ным раствором три- фторуксусной кислоты в ДХМ

Промывание дихлорметаном

Нейтрализация 10%-ным раствором триэтиламина в ДХМ

Промьюание дихлорметаном

Добавление 0,2 М раство ДМАП соли НФС-аминокислты в ДХМ (для производных фенилаланина и про- лина) или в ДХМ:ДМФ, 1;1 (для производного тирозина)

Добавление 0,2 М раство ра ДЦГК в ДХМ, проведение конденсации 60 мин

Промывание дихлормета- ном

Повторение цикла для присоединения следующей аминокислоты

Редактор М. Недолуженко

Составитель В. Теренин

Техред М .Ходанич Корректор М. Демчик

Заказ 4683/27Тираж ,579Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий П3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

.Лроизводственно -полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Т а б ri и ц а 2

6

2

4-Диметиламинопнридиниевые соли N-защицекных аминокислот общей формулы г R О .СНз сн где а) X -Р -нитрофенилсульфенил, R - бензил; б)X - О-нитрофеннлсульфенил, R - изопропил; в)X - тр«т -бутоксикарбонил, R - изопропил, в качестве промежуточных продуктов для синтеза пептидов. i W to сл 00 СП