Способ получения сорбента для аффинной хроматографии Советский патент 1986 года по МПК B01J20/10 G01N30/48 B01D15/08 

Изобретение относится к энзимоло- гии, аналитической биохимии, в частности к способу получения сорбентов для аффинной хроматографии менади- онредуктазы.

Цель изобретения - обеспечение се лективности сорбента к менадионредук тазе.

Способ получения модифицированного пористого аминосилохрома, содержащего на поверхности группу

НзСО-| 0

-(ш)

заключается в том, что силохром ами- нопропиловый подвергают взаимодействию с 4,5-диметокси-1,2-бензохи- ноном, взятом в избытке по отношению к аминогруппам.носителя, в водно органической среде при рН 7,2-7,5.

Процесс получения сорбента. можно представить следукщей схемой

силохром ,„,, . ,ju . HjCC

0«U«DfTpOnUWfeUg 3 HjCO CUJIOXpOHdНзСО-| # 0.

атштитШ |- СНЛ н-Чи 0

Модифицированный 4-Ы-5-метокси- 1,2-бензохиноном пористый аминоси- несет ковалентно связанный лиганд со структурой аминохннона, который является субстратом менади- онредуктазы. Данный хинон специфически взаимодействует с менадионре- дуктазой с образованием фермент- субстратного комплекса, что обеспечивает высокую избирательную сорбцию фермента из смеси белков.

Пример 1. Для синтеза сорбента используют силохром аминопро- пиловьй (квалификация ч)j который предварительно просеивают через сита для получения однородных частиц с диаметром 0,1-0,2 мм.

45 г. аминосилохрома (617 мкмоль аминогрупп на 1 г) промывают 400 мп дистиллированной воды, 200 мп 0,1 М боратного буфера, рН 8,0; 200 мп 0,1 М ацетатного буфера, рН 4,0, на стеклянном фильтре под вакуумом, создаваемым водоструйным насосом, Промытый силохром переносят в кол- 6V, содержащую 600 мг 4,5-диметок- си-1,2-бензохинона в 70 мм диметил174612

сульфоксида и 30 мп 0,07 М фосфатного буфера, рН 7,3.

Суспензию выдерживают при постоянном перемешивании 60 ч при 22 С.

5 Полученньм продукт промывают от несвязавшегося бензохинона 100 мл раствора диметилсульфоксида, 300 мп 0,1 М боратного буфера, рН 8,0; 300 мп 0,1 М ацетатного буфера,

10 рН 4,0, 300 мл дистиллированной воды.

П р и М е р 2. Препарат менадион- редуктазы представляет собой белковую фракцию гомогената из печени

15 крыс., содержащуюся в интервале 60- 80% насьпдения сульфатом аммония с удельной.активностью 4, 7 мкмоль/мин мг

Активность менадионредуктазы определяют по скорости восстановления

20 2,6-дихлорфенолиндофенола в присутствии ЫАДН при 600 нм.

Сорбент, полученный по примеру 1, упаковывают в колонку высотой 2,5см и диаметр.ом 1,3 см и уравновешивают

25 0,07 М фосфатным буфером с рН 7,5. На колонку наносят 2 мл исходного препарата менадионредуктазы, пропускают 30 мл 0,07 М фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,5 М NaCf. После отмывки

3Q от несвязавшегося белка через колонку пропускают 25 мл 30% этиленглико- ля в 0,07 М фосфатном буфере, рН 7,5, содержащего 0,5 М NaC. В злю-, ате определяют активность менадион- - редуктазы. Удельная активность очи-- щенного фермента составляет 436 МКМОЛЬ/МИН МГ.

35

Выход фермента 68%, о.чистка ме- надиоиредуктазы в 93 раза.

Пример 3, Использование сорбента для аффинной хроматографии препарата менадионредуктазы, полученного из гомогената печени крыс после изоэлектрического осаждения примесных белков при рН 5,0.

. Исходный неочищенный препарат менадионредуктазы с удельной активностью 2,8 МКМОЛЬ/МИН МГ в количестве 5 мп наносят на колонку высотой 8,7 см и диаметром 1,5 см, , упакованную сорбентом, полученном по примеру 1. Остальные условия эксперимента по примеру 2. Удельная

активность очищенной менадионредуктазы составляет 224 мкмоль/мин мг. Выход фермента 60% со степенью очистки в 80 раз.

312174614

Предлагаемый способ позволяет в менадионредуктазу и обеспечи- одну стадию получить аффинный сор- . веющий ее вьщеление из смеси бейт, избирательно связьшающий белков.