Способ определения гаптена в антигене Советский патент 1980 года по МПК A61B10/00 G01N33/54 

(54) CnOCCjB ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАПТЕНА В АНТИГЕНЕ

1

Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть ис пользовано для определения вакцинных препаратов из антигенных комплексов энтеробактерий.

Известен способ определения гаптена в антигене методом электрофореза в агаре р. 3Однако известный ctioco6 не позволяет определить точное количество гаптена в антигене. .

Целью изобретения является количественное определение гаптена на уровне отдельных рецепторов.

Эта цель достигается тем, что эритроциты параллельно сенсибилизируют исследуемым антигеном и референс-гаптеном, затем определяют их спецйфическую ктивность в реакции массивной гемаглютиНсщИи и по разнос ти показателей специфической активности определяют количественное содержание гаптена в антигене. .

Крометого, сенсибилизирукядая до.за исследуемого антигена в 10-20 раз превышает сенсибилизирующую дозу референс-гаптена.

Пример. Свежие или формалинизированные эритроциты отмывают физиологическим раствором рН 7,2

(раствор № 2) центрифугированием при со скоростью 2800-3000 об/мин. Осадок ресуспендируют до 2,5% концентрации фосфатным буфером рН-6,4 с

5 содержанием 0,85% хлорида натрия

(раствор № 1) и разливают в стерильные флаконы по 10-.25 мл. На каждый исследуемый препарат и контрольный гаптен берут по 3 флакона и в четвертый флакон заливают контрольные эритроциты. В пёраые 1-3 флакона добавляют разведенный раствором I 1 исследye sый антиген.

Сенсибилизирующие дозы антигена

5 равняются 50-100 мкг антигена на 1 мл 2,5% эритроцитов. Параллельно te другие 1-3 флакона добавляют референс-контрольный гаптен. Уль тразвуковой 0-антиген обрабатывают 0,02 М

-20 NaO.H при температуре 2ч. Полученный гаптен диализуют и лиофилизируют.

Иммунизация кроликов ультразвуковым 0-антигеном вызывала нарастание

25 титров антителдо 1:25000-1:50000. После обработки 0-антигена NaOH титры сывороток были равны или меньше 1:160-1:320. Сенсибилизирующая доза гептена в 10-20 раз меньше исследуемого антигена и равняется 5 мкг ranтёна на 1 мм 2,5% эритроцитов. Кроме того, готовят контрольные эритроциты, т.е. в один флакон добавляют физиологический раствор в том же объеме, что и разведенный антиген и гаптен. Для сенсибилизации эритроцитов все флаконы ставят в термостат или в водяную баню при З7с на 2 ч. За это время содержимое всех флаконов, перемешивают 3-4 раза. По истечении Времени сенсибилизации процесс прег кращагот добавлением 0,4% формальдегида рН 6,4 (конечная концентрация) Формальдегид добавляют в виде 4% раствора, разведенного раствором № Содержимое флаконов осторожно переме шивагот до и после добавления формалини и оставляют при комнатной, температуре 60 мин.Содержимое флаконов разливают в центрифужные пробирки, уравновешивают и центрифугируют в те чение 10 мин при 2,8-3 тыс. об/мин при +5 . Полученный осадок дваж ды отмывают раствором № 2, а затем ресуспендйруют до 2,5% концентрации 1/15 М фосфатным буферным раствором рН 7,2 с 0,85% хлорида натрия и 0,4% формальдегида. Полученные диаг ностикумы и контрольные эритроциты исследуют в РИГА с использованием агглютинирующих адсорбиройанных монорецепторных О-сывороток. РПГА ставят на полистероловых пластинках или используют бактериологические пробирки с круглым дном. В.ряды лунок или пробирок разливают по 0,4 мг раствора № 2 (по 12 лунок или пробирок). В первую лунку или пробирку добавляют разведенную в 2,5 раза сыво ротку, тщательно перемешивают и переносят во вторую лунку или пробирку 0,4 мл и т.д., титруют 10 луйок или пробирок. Из последних лунок ил пробирок 0,4 мл выливают. Титруют 3 раза. В первый ряд вносят диагнос тикум, приготовленный из гаптейа,в второй - диагностикум, приготрвлен.ный из исследуемого антигена, в тре тий добавляют контрольные несенси-билизированные эритроциты. Диагностикумы добавляют в количестве 0,050,07 мл в каждую лунку или пробирку Пл астины или пробирки встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 3 ч или до следующего дня на ч, после чего производят учет реакции. Реакцию учитывают по следующей схеме: . ( + ) - положительная (эритроциты равномерно устилают всю поверхность дна лунки или пробирки) ; (-) - отрицательная (на дне пробирки или лунки плотная пуговка или колечко правильной формы); (i) переходная (эритроциты рас пределяются по дну лунки, пробирки

784872 более концентрированно, по краю появляется плотный ободок). Число рядов зависит от количества исследуемых антигенов и монорецепторных сйвороток. Количество гаптенов и исследуемом препарате определяют путем приравнивания специфической активности диагностикумов, приготовленных из исследуемого антигена и контрольного препарата с известным количеством гаптена. Если специфическая активность диагностикумов, приготовленных из исследуемого антигена и референсгаптена при сенсибилизирующих дозах с десятикратным различием, одинаковы, то содержание гаптена в исследуемом антигене будет равняться 10%, с 20-кратным различием - 5% и т.д. Например, если специфическая активность контрольного препарата при сенсибилизирующей дозе 5 мкг равняется 1:40, а специфическая активность опытного препарата,при сенсибилизирующай дозе 50 мкг также равняется 1:40, то HS этого следует, что исследуемый антиген содержит 10% гап тена. При этом используемая монорецепторная сыворотка не должна реагировать с контрольными несенсибилизированными эритроцитами (результаты исследования антигенов, полученных из различных энтеробактерий разными способами, представлены в табл. 1 и 2) . . , , Из табл. 1 видно, что брюшнотифозная вакцина серии 59, полученная методом триптического переваривания при сенсибилизирующей дозе 50 мкг, дает чуЁствительность. к рецептору 0-9 в разведении 1:40 и к рецептору 0-12-1:20. При этом референс-гапт.ен при сенсибилизирующей дозе 5 мкг к рецептору 0-9 обладает чувствительностью в разведении 1:40, а к рецептору 0-12 также в разведении 1:40. Из этого следует,что в данной серий антигена (вакцины) содержатся 10% гаптена к рецептору 0-9 и 5% к рецептору 0-12. Это означает, что общее содержание гаптена в исс ледуемом антигене по двум исследуемым рецепторам (0-9 и 0-12) равняется 15%.При 1 сследовании аналогичного антигена бьшо установлено, что антиген серии 38 содержит 5% гаптена к рецептору 0-9 и 2,5% гаптена .к рецептору €-12. Так как эти исслёдования проводились параллельно в аналогичных условиях (с использованием одной серии контгЗольного гаптена, формалинизированных эритроцитов, монорецептррных сыворбток и т.д.), можно сравнивать количество содержания 0-антигенов и 0-гаптенов в препаратах производства различных предприятий. Хотя исследуемые брюшнотифозные антигены были приготовлены по одной технологии (методвКГтрйптического переваривания) разными предприятиями с помощью предлагаемого метода, ё KOpOtкий срок возможно установление качественных и количественных различий между ними на уровне отдельных рецёп торов 0-антигена. Так, было установлено, что содержание гаптенов в 0-ан тигейе производства Ташкентского НИИВС в два раза меньше, чем в аналогичном антигене производства Ленинградского НИИВС (7,5 и 15% соответственно). Таким образом, возможно и установление количественного со держания 0-антигенов в исследуемом препарате (вакцине) простым вычислением: в препарате производства Ленинградского НИИВС содержится 15% гаптенов (по рецепторам 0-9 и 0-12), а на долю антигена приходится 85%, в препарате Ташкентского НИИВС 7,5 и 92,5% соответственно. Аналогич ные качественные и количественные ; различия были получены при исследовании других серий 0-антигенов, кото рые представлены в табл. 1. В брюшнотифозных антигенах, вьаделенных методом прогревания бактериальных суспензий при 56-57 С в тече-ние 1 ч (гретая вакцина), обнаружено содержание гаптена к. рецептору 0-9 10%, к 0-12 5%. При исследовании Исследование гаптенов в

Контроль 0-гаптен серия II 0-антиген ЛенНЙИВС серия 59

0-антиген ТашНИИВС серия 38 .

и-антиген ТашНИИВС серия 38 (а)

6-антиген ЛенНЙИВС серия 36 0-антиген ЛенНЙИВС серия 36 (а)

0-аитиген ЛенНЙИВС серия 52 (а)

0-антиген (, гретая вакцинaJ MHИИBC серия 1

0-антиген (фаголизат) ТбилНИИВС серия 3

Ультразвуковой 0-антиген неактивизированный серия 2

100

100 10

40 20 5

2,5

5 10

10 10

2,5

5 5

1,25

10

5

10 10

40 20

5

Нет

Нет

Нет

Нет Нет

Нет 0-антигенов, полученных с помощью дезинтеграции бактерий Фагон (фаголизат) и ультразвукового брюшнотифозного О-антигена, гаптены в них не обнаруживаются. Исследование антигенов, полученных из других сальмонеллезных бактерий (сальмонелла мышиного тифа) с по.мощью тидpOkcилaминa при в течение 72 ч показали, что в этих препаратах также содержится гаптен (см. табл. 2). Например, к рецептору 0-4 2,5%, а к рецептору 0-12 2,5%. Аналогичные исследования 0-антигенов мышиного тифа, паратифа А и паратифа В, полученных методом дезинтеграции бактерий фагон (фаголизат) и ультразвукового 0-антигена из этих же штаммов (см. табл. 2) показали, что в них гаптены не содержатся. Использование предложенного способа позволит оценивать качественное и количественное содержание 0-гаптенов на уровне отдельных рецепторов и таким образом сравнивать и отбирать лучшие методы получения 0-антигенов. способ создает возможность в лабораторных условиях оценивать за короткий срок (несколько часов) не только препараты, но и методы их производства. Таблица отифозных антигенах Исследование гаптенов в антигенах мышиного с помощью гидроксиламина при 57с в

ультразвуковой Т.М. (контроль)

С-1.

С-1

С-2

R-8

Ультразвуковой антиген мышиного тифа серия 2 неактивированный

0-антиген фаголизат мышиного тифа ТбилНИИВС серия 2

Формула изобретения

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

Источники информации, принять в0 внимание при экспертизе

1. Mil net- К.е. and an. Структура и биологические свойства поверх-, ностиых антигенов арамотрицательньрс бактерий. J, Bacterlalogy Reveiw 1963, 27, 4,, p. 352-368. Таблиуа.2 тифа, полученных течение 72. ч..