Штамм бактерий 199-пРОдуцЕНТ лиМОННОй КиСлОТы Советский патент 1981 года по МПК C12N15/00 C12D1/04 

Изобретение относится к микробио логической промышленности и касаетс нового штамма бактерий, способного накапливать лимонную кислоту, в условиях глубинного культивирования на мелассных средах. В настоящее время при производстве лимонной кислоты используют мицелиальные грибы, дрожжевые и бак териальные культуры. Так, известен штамм гриба AspergiHus niger Р-1 как продуцент лимонной кислоты. Этот штамм на мелассных средах образует в среднем 97,8% лимонной кислоты от суммы кис лот jl . Мицелиальные штаммы обладают дли ным циклом развития, во время культивирования накапливаются побочные кислоты. На ранних стадиях развития вследствие малой начальной скорости роста эти штаммы очень подвержены инфицированию. Выращивание и получе ние посевного материала, по существу, является отдельным производством. Эти особенности мицелиальных штаммов в значительной степени усло няют производство и повышают стоимость конечного продукта. Одним из средств увеличения производства лимонной кислоты без значительных капитальных вложений является получение бактериальных штаммов-продуцентов лимонной кислоты. Бактериальные культуры, облс1дая более высокой начальной скоростью роста и более коротким циклом развития, при этой же производительности способны увеличить производство кислоты при тех же мощностях и сократить расходы на борьбу с заражением посторонней микрофлорой. Цель изобретения - штамм бактерий, способный накапливать при культивировании в глубинных условиях на мелассных растворах лимонную кислоту за более короткий срок и более устойчивый к заражению.посторонней микрофлорой, чем штамм мицелиального гриба за счет высокой начальной скорости роста, а также расширение арсенала продуцентов лимонной кислоты. Для получения данного штамма из естественных углеводбогатых субстратов были выделены бактериальные культуры. Они были проверены на твердых индикаторных средах на способность к образованию лимонной кислоты. В результате лабораторных исследовани был отобран штамм, идентифицированный как Arthrobacter terregens 199, выделенный с виноградной ягоды, кот рый имеет следующие морфологические и физиолого-биохимические признаки. Морфологические признаки. Клетки округлые и палочковидные, неподвижные, грамвариабильные. Цикл развития: кокк-палочка-кокк. Размер кокковидных клеток О,6-0,8 мк, размер палочковидных форм 2,0-2,5Х 0,50,6 мк. Сусло-агар. Колонии 2-4 мм в диаметре, круглые, выпуклые, глад кие, матовые, бесцветные с ровньи ш или фестончатыми краями.Не пигментированные. Физиолого-биохимические признаки Отношение к кислороду: облигатный аэроб. Максимум роста при 28-30с, при не растет. Оптимум рн - 6, 7,0. Молоко не пептонизирует, желатин не разжижает, крахмал не гидролизует, нитраты не восстанавливает, индол не образует, лецитиназа отсут ствует. Этанол энергично окисляет. Отношение к углеводам: усваивает са харозу, глюкозу, фруктозу, арабинозу, ксилозу, галактозу, маннозу, рамнозу с образованием кислоты без выделения газа. Не усваивает лактозу, мальтозу. Отношение к спиртам. Усваивает глицерин, сорбит. Не усваивает сали цин, дульцит, инозит. Предпочитает аммонийные формы азота. Пример. Культивирование веду в среде следующего состава, г/л: мелисса 100, (NH)2S04 1, MgS047H2 0,5, 1,5, рН 6,7. Содержание сахара в мелассе 50%. Среду разливают в качалочные колбы емкостью 750 млпо 50 мл среды в каждую, после чего стерилизуют при 0,5 ати сверх нормального давления. Посевным материалом служила двухсуточная х/льтура с сусло-агара. Засев опытных колб производили петлей, по одной петле на каждую колбу. Культивирование ведут на качгипке при 180 об/мин и 30°С. Через 96 ч с начала выращивания в культуральной жидкости накопилось 35 мг/мл лимонной кислоты. Выход продукта составил от внесенного в среду источника углерода. Лимонная кислота составляла 98% от суммы кислот в растворе. Предлагаемый штамм Arthrobacter terregens 199 Представляет собой вновь выделенный штамм бактерий/ спо собный накапливать лимонную кислоту при культивировании на мелассных растворах. Основой для создания крупнотоннёикного производства лимонной кислоты являются глубинный и непрерывный способы культивирования. При этих способах преим щество получают бакте риальные штаммы, которые, обладая высокой начальной скоростью роста, в меньшей степени подвержены инфицированию. Бактериальные продуценты не требуют отдельного выращивания посевного материала. Еще одним преимуществом бактериального штамма является то, что, помимо основного продукта, его биомасса является дополнительным источником белка, пригодного для подкормки сельскохозяйственных животных. В настоящее время высушенный мицелий Aspergillus niger идет в качестве добавки в рацион животных, но он является грубым кормом, а биомасса бактерий более пригодна для этой цели, к тому же обогащенная витаминами и аминокислотами. При культивировании предлагаемого штамма бактерий на мелассных растворах концентрация -лимонной кислоты в растворе через 96 ч культивирования составляет 3,5%, что составляет 70%- от внесенного в среду источника углерода. Использование данного штамма позволяет интенсифицировать существующий способ производства лимонной, кислоты за счет следующих факторов: сокращение сроков ферментации, отсутствие побочных кислот, лимонная кислота от суммы кислот составляет 98-99%, в то время как при использовании штамма Aspergillus niger эта величина составляет около 93%, увеличение выхода конечной продукции посевного материала для мицелиальных штаммов, сокращение затрат на борьбу с посторонней микрофлорой. Формула изобретения Штамм бактерий Arthrobacter terregens 199 - продуцент лимонной кислоты. Хранится в коллекции культур микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под №149. Морфологические признаки. Клетки неподвижные,округлые и палочковидные, грамвариабильные. Цикл развития: кокк-палочка-кокк. Размер кокковидных клеток 0,6-0,8 мк, размер палочковидных форм 2,0-2,5 0,50,6 мк. Сусло-агар. Колонии размером 2-4 мм в диаметре, круглые, выпуклые, гладкие, матовые с ровным или фестончатым краем. Пигменты не образуют. Физиологические признаки. Отношение к кислороду: облигатный аэроб. Максимум роста при 28-30с, при не растет. Оптимум рН 6,8-7,0. Молоко не пентонизирует, желатин не разжижает, крахмал не гидролизует, нитраты не восстанавливает, индол на образует.

Отношение к углеводам. Усваивает сахарозу, глюкозу, фруктозу, арабинозу, ксилозу, галактозу, маннозу, рамнозу с образованием кислот без выделения газа. Не усваивает лактозу, мальтозу.

Отношение к спиртам. Усваивает глицерин, сорбит. Этанол энергично окисляет. Не усваивает салицин, дульцит, инозит.

Предпочитает аммонийные формы , азота. .

При культивировании заявляемого штамма в аэробных условиях при в среде, содержащей раствор свекловичной мелассы, источник азота и неорганической соли, через 96 ч концентрация лимонной кислоты достигает 3,4-3,6%, что составляет около 70% от первоначально внесенного в среду источника углерода.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР №568677, кл. С 12 D 1/04, 1975.