Способ получения лимфоцитарныхСуСпЕНзий из лиМфОузлОВ КРупНОгОРОгАТОгО CKOTA Советский патент 1981 года по МПК C12N7/00 G01N33/54 

Для достижения указанной цели после начесывания суспензию клеток наслаивают ех tempore по градиенту плотности фиколла и центрифугируют 30-40 мин, а в качестве буферного раствора используют смесь следующего состава при рН 7,2- 7,4:

0,0001-0,0002 н. раствор MgCIg 0,1-0,2мл 0,1-0,2 н. раствор NaClдо .1 л.

Пример. При центрифугировании суспензии лимфоцитов, полученной из брыжеечных лимфоузлов, при 400 g (1800 об/мин) используют буфер следующего состава: 0,85%-ный раствор NaCI при рН 7,2, обогащенный Mg++ (из расчета по 0,2 мл 5% MgCla на 1000 мл 0,85%-ного раствора NaCl).

Суспензию лимфоцитов центрифугируют при 1800 об/мин в буфере следующего состава:

0,1 мл 4%-ного хлористого магния на 1000 мл 0,85%-ного раствора NaCl.

0,1 мл 5%-ного хлористого магния на 1000 мл 0,85%-ного раствора NaCl.

0,1 мл 6%-ного хлористого магния на 1000 мл 0,85%-ного раствора NaC.

0,2 мл 4%-ного хлористого магния на 1000 мл 0,85%-ного раствора NaCl.

0,2 мл 5%-ного хлористого магния на 1000 мл 0,85%-ного раствора NaCl.

0,2 мл 6%-ного хлористого магния на 1000 мл 0,85%-ного раствора NaCl.

При конечных и средних значениях буфера не происходит склеивания лимфоцитов и полученная суспензия лимфоцитов содержит необходимое для абсорбции количество клеток (50-70. 10 клеток в 1 мл суспензии).

Время, затраченное на получение брыжеечных лимфоузлов при убое крупного рогатого скота и на выделение чистых лимфоцитов, доведено до минимума (30- 40 мин). Это дает возможность повысить жизнеспособность лимфоцитов до 90-95%. При этом клетки выделяют из лимфоузлов в следующем порядке: поочередно начесывают лимфоузлы от каждого животного, немедленно наслаивают суспензию клеток на градиент плотности (9% фиколл-f 33% верографин), центрифугируют 30-40 мин

при 400 g и только после этого приступают к обработке лимфоузлов следующего животного.

Таким образом, во время получения

5 чистых лимфоцитов клетки постоянно находятся в благоприятной среде (в градиенте плотности или в самом лимфоузле), которая максимально сохраняет их жизнеспособность.

0 Жизнеспособность лимфоцитов проверяют после центрифугирования с помощью 1%-ного раствора трипановой сини по Kissmeyer-Nielson. Красят в. течение 10- 15 мин и под микроскопом устанавливают

5 жизнеспособность клеток. Полученные предлагаемым способом суспензии лимфоцитов содержат не более 5-10% мертвых клеток, что вполне пригодно для дальнейшей работы.

Формула изобретения

Способ получения лимфоцитарных суспензий из лимфоузлов крупного рогатого 5 скота, включающий механическое начесывание клеток в буферный раствор, центрифугирование в градиенте плотности фиколла, отличающийся тем, что, с целью повышения жизнеспособности клеток и 0 предотвращения их склеивания, после начесывания суспензию клеток наслаивают ех tempore по градиенту плотности фиколла и центрифугируют 30-40 мин, а в качестве буферного раствора используют смесь следующего состава при рН 7,2-- 7,4:

0,0001 - 0,0002 н. раствор MgCb

0,1-0,2 мл 0,1-0,2 н. раствор NaClдо 1 л.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. М. Vaiman et al The SL-A Histocompatibility system in the SUS SCROFA SPECIES.

1.Transplantation, 1972, v. 14, 5.

2.R. L. Spooner et al, Eridence for possible major histocompatibility complex

(BLA) in cattle, I. j. Immunogenetic, 1978.