Способ получения носителей для иммобилизации белковых веществ Советский патент 1981 года по МПК C08G69/14 C08G69/48 C08F20/44 C12N11/08 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВо

Изобретение огносигся к биохимии, а именно к способам получения носителей для иммобилизации биологически активных белковых веществ (ферментов, пептидных гормонов, антител). Известен способ получения носителей для иммобилизации белковых веществ путем модификации полиамидного нерастворимого носителя-найлона, офаботкой его диметилсульфатом при 100° С в щелочной среде с последующей гфомывкой абсолют-, ным этанолом д Однако при активации диметилсульфаг быстро растворяет найлон, результц- гом, чего является ухудшение качества нс свтепя. Кроме того, диметилсульфат - вьь сокотоксичное вещество, что затрудняет осуществление способа в производственном масштабе. Цель изобретения - улучшение качества носителей и обеспечение безопасности процесса. Поставленная цель достигается способом получения носителей для иммобили |зации белковьос веществ, заключающимся в модификации нерастворсгмых полимеров с азотсод жащвмн функциональными группами путем обработки вх восстановителями в среде органических .растворителей при 4О-16О С. Обычно в качестве вышеуказанных подимеров используют полиамидные (например капрон, натуральные шелк) или поаинит-. ршшные, например вопвшфилонитрип) попимеi ры, в качестве органическвх растворителей :диэтиловьЁК , тетрагифофуран, н-бу- ТШ10ВЫЙ спщэт, тойуоя, лиметиловый эфир этиленгликопя, диметвп жый эфир диэтиленгликойя ияи смесь аоследввго с дисжсаном, а в качестве воссгешовител используют комолексшые металлогкфиды (в частности витийвл1омший1-шфид и нЕатрийборгвгдрид) в количестве 2-15% от веса полимера Ш1И металлически натрий в количестве от веса полимера и процесс ведут соотвегствевно при 4(Х.16Ос или при 8О-12О С, причем в последнем елчае в щ исутсгвии сшфта. 385 Существенным отличием способа является то, что модификацию указанных полимеров гфоводят путем обработки их восстановителями в среде органических растворителей при 40-1бОС. Способ осуществл5пот путем нагревания полимеров и восстановителей в среде указанных выше растворителей в указанномтемпературном .интервале. При активации полимеров комплексными металлогидридами растворитель должен хотя бы частично раствфять восстановитель но не вступать с ним в химическое взаимодействие или вступать лишь очень медгленно. Этим требованиям удовлетворяют указанные апротонные полярные растворители - диэтиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, диметиловый эфир этиленгликоля. При активации щелочными металлами в присутствии спиртов ПОДХОДЯЩИМИ ЯВЛ1ПОТся любые инертные раствфители, имеющие достаточно высокую температуру кипения для гонкого дйсперпфования металла. В случае металлического натрия в качестве раств(рителя удобно применять толуол. В зависимости от типа полимера и используемого восстановителя предпочтительные условия модификации варьируют в широких гфеделах. В ходе процесса модификации восстанавливаются азотсодержащие функциональные группы поверхностного слоя полимеров. Амидные группы восстанавливаются до вто ричных аминогрупп, нитрильные группы до Первичных аминогрупп о R-CO-MH-R- R-CH -NH-R R-CHri-NHj К образовавшимся первичным или вторичным аминогруппам можно присоединить белковые вещества непосредственно или через вставки. В качестве вставок предпочтительно использовать полифункцидааль ные раствс имые полимеры (налример по лиакриловую кислоту, попиэтиленимин). И мобилизацию белковых: веществ осуществл ют при помощи связывающих реагентов, о разующих ковалентные связи между функцисяальными группами поверхностного сло носителя и белковых молекул (например водорастворимого; карбодиимйДа глутарового альдегида, иминоэфиров дйкарбоновы кислот). ОпИЬываемый способ дает возможность получить носители в виде тонких йленок и тканей, что является удобаым во многих областях применения. Это невозможно получить по извecтнo fy способу, так как пр нагревании с д им ет ил сульфатом полиамидные полимерные пленки или ткани теряют прочность и разрушаются. П р и м е р 1. В 20 мл абсолютного тетрагидрофурана помещают 150 мг капроновой ткани, добавляют 12 мг литийалюминийгидрида и кипятят в течение 20ч (при ). Ткань промывают водой (Зх t 25 мл), ОД и НСё(2х25мл),снова водой (4x25 мл) и высушивают на воздухе. Активированный капрон помещают в 15мл 5%-ного раствора полиакриловой кислоты в О,О5 М фосфатном буфере, рН 10, и Добавляют 25 мг связывающего реагента (1-циклогексил- 3- (2-морфолиноэтил) 3-«ар-. бодиимид метил-п-толуолсульфоната). Реакционную смесь вьщерживают при комнатной температуре 3 ч . Капрон промь1вают 0,О5 М фосфатным буфером, рН Ю, водой, помещают в 3 мл высокоочищенной глюкозооксидазы. в О,О1 М фосфатном буфере, рН 7 (концентрация белка 1мг/мл), и добавляют ЗО мг того же связывающего реагента. Реакционную смесь выдер живают при +3С 12ч, i, капрш промывают 0,О1 М фосфатным буфером, рН 7. Ферментативная активность 65 Е/г. Пример 2. К ЗО мл смеси абсо лютного диоксана и абсолютного димет илового эфира диэтиленгликоля (2:1) добавляют 16 мг натрийборгидрида, помеща1рт 800 мг порошкообразного гшпрона. Через несколько минут добавляют О,02 мл четыреххлористого титана и кипятят 3 ч (температура смеси 12О°С). Капрон промывают водой (3x35 мл), О,1 н НС (2x35 мл), снова водой (4x35 высушивают на воздухе. Активированный капрон помещаю в 20 мл 5%-4ioro раствора полиэтиленимина в 0,1 М фосфатном бу- фере, рН 8,5, и .добавляют 80 ivfl связывающего реагента (дигидрохлорида диметилсуберимидата). Реакцисмную смесь выдерживают при 1 ч. Промывают О,О1 М фосфатным буфером, рН 8,5, помешают в 15 мл раствора очищенной ще. л очной протеазы в 0,01 М фосфатном буфере, рН 9 (концентрация белка 1 мг/мл) и добавляют 8О мг того же связывающего реагента. Реакционную смесь вьщерживают при 15 ч. Промывают 0,01 М фосфатным буфером, рН 9. Ферментативная активность 9 Е/г. Пример 3. В 25 мл абсолютного диметилового эфира этиленгликоля помещают 2ОО мг полиакрилонитрильного волокна, добавляют 2О мг литийалюминийгидрида и кипятят 5 ч (температура смеси ). Попиакрнлоннгрил промывают водой (ЗхЗО мп), 0,1 н нее (2x30 мп), снова водой (4x30 мп) и высушиваюг на воздухе. Акгивнрованный попиакрилонигрип помещают в 10 мл высокоочищенной глюкозооксндазы в О,1 М фосфагном буфере, рН 7 (конценграцня белка 1 мг/мл) И добавляюг 0,2 мл 4%-ного расгвфа глугароБого альдегида. Реакционную смесь вьшерживаюг при 12 ч. Полиакрилонигрил промываюг 1,01 М фосфатным буфером, рН 7. Ферментативная активность 31 Е/г. П р и М е р 4. В 45 мл абсолютного толуола помещают 12О мг металлического натрия и кипятят при перемещивании до расплавления натрия. В реакционную смесь добавляют 40О мг полиакрилнитриповей ткани и кипятят ЗО мин, добавляя при этом небольщими порциями 15 мл н-бутилового спирта (температура смеси 110 С). Полиакрилонитрио промывают водой (3x45 мл), 0,1 н нее. (2x45 мл) и высушивают на воздухе. Активированный полиакрилонитрил помещают в 25 мл 5%-ного раствора гексаметилендиамина в 0,05 М фосфатном буфере, рН 8,5. Реакционную смесь выдерживают при 0°С 1 ч. Полиакрилетситрнл промывают 0,О5 М фосфатным буфером, рН 8,5, водой, пометают в 20 мл раствора высокоочищенной йнвертазы в О,1 М ацетатном буфере, рН 4 (концентрация белка 1,5 мг/мл), и добавляют 0,2 МП 4%-ного раствора глутарового альдегида. Реакционную смесь выдерживают при 12 ч. Полиакрйпонитрил промывают О,1 М ацетатным буфером, рН 4. Ферментативная активность 52 Е/г. Пример 5. В 25 мл абсолютного диметилового эфира диэтиленгпиколя помещают 4ОО мг капрсиовой пленки, добавпяют 8 мг литийалюмннийгидрида и кипятят 3 ч .(температура смеси ). Кащюн промывают водой (3x20 мл), О,1 н НСС (2х2О мл) снова водой (4х2О мп) и Brfсушивают на воздухе. Актив фованный капрон помещают в 1О мл 5%-ного раствсфа полиакриловой кислоты в О,О5 М фосфатном буфере, рН 1О, добавляют 2О мг связывающего реагента (l-циклoгeкcн З-(2 -мopфoпинoэтил)l -карбодиимид метид-п-топуолсульфоната). Реакционную смесь выдерживают при комнатной темп атуре 3ч. Капрсю промывают 0,О5 М фосфатным буфером, рН 10, водой, помещают в 3,5мл раствора комплекса иммуноглобупин-аероксидаза в О,О1 М фосфатном буфере, рН 7,2 (концентрация белка 0,8 мг/мл), в добавляют 10 мг того же связующего реагента. Реакцисжную смесь выдерживают при 12 ч, капрся промывают О,О1 М фосфатным буфером, рН 7,2, 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2, сод жащнм 1 М КСе, к снова О,01 М фосфатным буфером, рН 7,2. Ферментативная активность 45 Е/г. П р и М е р 6. В 20 МП абсояютногч диэтйлового эфира помещают 12О мг натурального шелка, добавляют 15 мг яитийалюминийгиич ида и кипятят 12ч (гемаература смеси )« Ткань 1фомывают водой (3x25 мп),Ю,1 в нее (2x25 мп), снова водой (4x25 мп) и высушивают на воздухе. Активированный шелк помешают в 3 мп расгвсра инсуп1ша в О,О1 М фос-. фатном буфере, рН 7,2 (ковцентрация белка 1 мг/мп), и добавляют Ю мг свя- зующего реагента (1нциклогексю1- 3-(2-Морфопиноэтвп)}-карбодиимид Meren-Q-ipoiпуолсуяьфонат). Реакционную смесь выдерживают 1фи 3°С 12 ч, шелк «фомываюг о,О1 М фосфатным буффом, рН 7,2, сожержащнм 1 М КСС, и снова О,О1 М фосфатным буфером. рН 7,2. Д|ш BtiajranBзапви иммобилюзованного гормона образец офабатывают ангвтепом - комплексом вммуногпобупвна-пероксидааы в О,О1 М трво-НСЕ буфере, рН 7,2 концевтрапвя антитела О,8 мг-мп, объем расгво{% 1,1 мп) 3 traca. Неасссщиярованный белок отмьюают O,OJ. М тркс-HCt , рН 7,2, содержаиим 1 М КСв в О,О1 М , гркс-НСб буфером, рН 7,2. Акпшвосгь аосовката 34 .Е/г, Таким образом, опвсываемый способ аолученвя носвтевей дпя вммобтвзавин белковых веществ обеспечивает невзмея кость механмчеасоб 1фочвоств носвгеяя после актшаапвв ксходаого полимеру воопроизводвмость акпюадвя, так как процесс орсмводят в бовее мягких условиях R более 1фоаоажвтепьное еремя в увелечение беэовасвосгв процесса, так как вскяючаегса (ге выс(жотсжскчи го двметвлсульфага. Формула взобретеняя 1. Способ поаучвякя носителей для вммобкпвзаввв бросовых веществ путем мовфвкадвв верс сгворвмых полвм юв с вотсоя нкаошмв функциональными группаMB прв вошлренноА температуре, отличающейся тем, что, с целью уттуч еввя качества носителей и обеспечения

безопасносги процесса, модификацию полимеров проводят путем офаботкв их восстановитепямв в среде органических расгворигепей при 40-160С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1975, 304, c. 3O7-316 (прототип).