Способ получения полимерного реагента для ковалентной иммобилизации биологически активных соединений Советский патент 1991 года по МПК C08F2/20 C08F220/10 C12N11/08 

Изобретение относится к химии полимеров, а именно к способу получения пол- имерного реагента для ковалентной иммобилизации биологически активных со единений, и может быть использовано в би- отехнологии и инженерной энзимологии для создания препаратов с иммобилировэн- ными биологически активными соединениями.

Целью изобретения япляегся повышение связывающей способности полиме| о- го реагента по отношению к биологически активным соединениям и повышение экологической чистоты процесса

П р и м е р 1 fi 800 мл деминерализованной виды при перемешивании и 50°С растворяют 20 г полипиниллирролидона (мол.масса 20000 -1 000) В полученный раствор повер чнгг i no m тивного рещестза вносят 82 г ф 1 ,;,., i п; трио (Ю мас.% У раствору П D; П кмпир jf/pc при

перемешивании со скоростью 170-200 об/мин прибавляют иг одную смесь моно- метроо, состоящую из 94 мл хлорбензола, 29, / г (0,30 моль) диметакрилата диэтиленг- ликоля 3,55 г (0,025 моль) бутилметакрилато и 5.32 г (0,125 моль) глицидилметакрилата. Добавляют 0,5 г инициатора - 2,2-ззо- бис(изо-бутиронитрила) (ДАН) и перемешивают при 80 С, наблюдая за процессом полимеризации отбора проб реакционной смеси. После1 25 чш (образуются твеодые частицы) добавляют 1597 г (0,36 моль) глицидилметаконпата Реакционную смесь перемешивают 6 ч Полимео отфильтровывают промь ,лог промывают водой, ацетоном, экстра: t- iyi ji бензолом Сушат при в течение о ч Получают 54,20 г продукта(выход 9о / ,

По-1 чениьгй п|и),1/кт -аракгеризуется с1 ,,мщими по1 ti i.j iiM irii1 Содержание ) , i- pynp 245 r-fiii г iui фгдилено поО

VI

ел

CJ iO

:

теициометрическим титрованием хлористоводородной кислотой в диоксане), элементный анализ: С 60.22%, Н 7,09 %, удельный объем о воде 2,0 см3/г. диметилформамиде 4.1 см3/г. бензоле 3,0 см3/г. В ИК-спектрах имеется максимум сорбции при 1210 см (сорбция эпоксигрупп). Продукт получен в виде регулярных частиц с размером 0,050- 0,160 мм. Содержание основной фракции (по весу) 68% (100-140 мкм).

Данные по примерам 2-8 приведены в таблице, где показан синтез полимерных реагентов для иммобилизации биологически активных веществ.

П р и м е р 9, Иммобилизация белков на полученных носителях,

1,00 г носителя, полученного согласно примеру 1, суспендируют в 10 мл 0,1 н, ацетатного буфера (рН 7,5), который содержит 32 мг пеннициллинацилазы. Смесь перемешивают при 4°С в течение 24 ч. Полимер отфильтровывают, промывают, промывают 0,1 н. хлоридом натрия, водой. Хранят при 4°С в 0,1 н. фосфатном буфере (рН 2,5). Активность иммобилизованной ацилазы 340 ед./г.

П р и м е р 10. 1,00 г носителя, полученного согласно примеру 2, суспендируют в 10 мл 0,05 н. ацетатного буфера (рН 6,6), прибавляют 350 мг трипсина с удельной активностью 36 ед. акт./мг и перемешивают при - 4°С в течение 6 ч. Затем продукт отфильтровывают и на фильтре промывают водой. На носителе связан трипсин с активностью 10672 ед. акт.

П р и м е р 11. Иммобилизация иизкомо- лекулярных биологически активных веществ.

К раствору 0,61 г Ьфенилаланил-L-ac- паргиламида в 30 мл воды добавляют 1,0 г носителя, полученного по примеру 3. Перемешивают при 20°С в течение 10ч. Продукт фильтруют, промывают водой, ацетоном. Сушат на воздухе. На носителе связано 0,58 г пептида(определено по аминокислотному анализу).

П р и м е р 12 (сравнительный). 2,00 г бромцианактивированной сефарозы выдерживают в 0,05 н. хлориде натрия о течение 3 ч. Затем раствор хлористого натрия отмывают 0,01 м дикарбонатом натрия и гель переносят в 50 мл 0,05 н. дикарбонатного буфера (рН 8,5), прибавляют 700 мг трипсина с уд. акт. 40 ед. акт./мг и перемешивают при +4°С в течение 6 ч. Затем продукт отфильтровывают и на фильтре промывают водой. На носителе связан трипсин 3,5 мг/г.

П р и м е р 13 (сравнительный), 1,00 г эпоксиактивированного сферона суспендируют в 50 мл 0,05 н. бикарбонатного буфера (рН 8,5), прибавляют 350 мг трипсина с уд. акт. 40 ед. акт./мг и перемешивают при + 4°С в течение 6 ч. Затем продукт отфильтровывзют и па фильтре промывают водой. На носителе связано 12 мг трипсина.

Примеры 14 (сравнительный, известный). В 6 л колбе с термометром, насадкой Дина - Штарка, отточным холодильником,

трубкой для ввода азота, помещают 1740 i гексана, 1100 г перхлорэтилена, 9 г эмульгатора и 5 г сухого льда. При перемешивании и продувании азотом при 50°С прибавляют смесь, состоящую из 640 г метанола, 160 г

воды, 240 г метиленбисакриламида, 30 г ал- лилглицидного эфира, 30 г глицидилметак- рилата, 6 г 4,4-азобис(4-циановалериано- сой) кислоты. Смесь перемешивают при 65- 70°С в течение 6 ч. После этого реакционная

смесь выдерживается при указанных условиях еще 4 ч, после чего охлаждается до комнатной температуры. Полученные частицы полимера отфильтровываются в течение 12 ч, высушиваются в вакууме при 40°С.

Активность иммобилизованной ацилозы достигает 122 ед./г.

Формула изобретения Способ получения полимерного реагента для ковалентной иммобилизации биологически активных соединений путем радикальной эмульсионной сополимериза- ции глицилидметакрилата или аллилглици- дичового эфира с моновиниловым

сомономером и сшивающим агентом в присутствии органического растворителя - по- рообразователя в среде водного раствора поверхностно-активного вещества, отличающийся тем. что, с целью повышения

связывающей способности полимерного реагента по отношению к биологически актив- ным соединениям и повышения экологической чистоты процесса, в качестве моновинилового сомономера используют

бутилметакрилат, в качестве сшивающего агента - диметакрилат диэтиленгликоля, к водному раствору поверхностно-активного вещества добавляют 1-10% фосфатов щелочных металлов от массы раствора, причем

в начале сополимеризации в реакционную смесь вводят 20-25 мас.% глицидилметак- рилата или аллилглицидилового эфира от их общего количества при массовом соотношении бутилметакрилат: диметакрилат диэтиленгликоля: глицидилметакрилат или аллилглицидиловый эфир, равном 1:5,8- 8,4:1,2-7,2, и через 0,25-1,0 ч вводят остальное количество глидицилметакрилата или аллилглицидилового эфира.

800

800

Поливинил- пиррол ндон (ПВП) 20 ПВП 20

щелочного

, мл я смесь

ов, г

Na-jPO,,

Ј2 г (102)

Хлорбензол 94

Глициднл- метакрилат (ГМА) 5,32

Na,POv

41 г (52)

Хлорбензол 48

ГМА 25,56

ДМЭГ 19,8

Диметакрилат БМА 3,55

дичтилен гликоля 1ДМЭГ) 29,7

Бутилмета- крилат (БМА) 3,55

800

800

800

800

800

800

800

ПВП 20

Na,POv

41 г (52)

Хлорбензол 48

1ТЗП 20

KH,POi, 3, (1)

Бутилацетат 94

ГМА 25,56ГМА 18,1

ДМЭГ 19,8

БМА 3,55

ЯМЭГ 24,75 БМА 3,55

П| ливинкл-

спирт

20

Наг11 0ч 41 г (5%)

Хлорбензол 94

ГМА 25,56

.ТМЭГ 19,8 БМА 3,55

ПВП 20

NaHP04 8,2 г (12)

Хлорбензол 94

Аллилглици- дилов эфир (АГЭ)

ДМЭГ 29,7 БМА 3,55

ПВП 20

Ка3РО„

82 г (10Z)

Хлорбензол

94

АГЭ 20,52

ДМЭГ 198 БХА 3,55

ПВП 20

10 г

Хлорбензол 94

ГМА 137,4

ДМЭГ 124 SMA 3,55

ПВП 2Q

Na,PO, 120 г

Хлорбензол 94

ГМА 38,55

ДМЭГ 4,8 SMA 3,55

Изобретение относится к области химии полимеров и позволяет получить полимерные реагенты для ковалентной иммобилизации биологически активных соединений с высокой (135-265 мг/r) связывающей способностью экологически чистым способом. Это достигается радиальной эмульсионной сопо/шмеризяцией смеси 1 мае.ч. бутилме- такрилата с 5,8-8 4 мае.ч. диметзкрилата ди- этил енгл и кол я и 1,2-7,2 мае.ч глищ)дилметакрилага или аллплглицидило- вого эфира в присугстпии органического растворителя - порообразовагеля ипооерх- иостно-активного вещества г растворенным в смеси 1-10 мас.% Фосфата щелочного металла на первой стадии и добавлением 75- 80% глицидилметакрилата или аллилглицидилового эфира через 0,25-1.0 ч на второй стадии синтеза 1 табл со С

McU-Сгвое СООТНОШУ-

Ьрем добаь ечяя в тор с1 ч птраии Mc- ii омера, ч

Прслолжительность синтеза, Ч

1:2:,0:10,3

ЛАК :, о

.эЗ

- ,P -И

40

h iHHt i

- t РЛ.

Ь ВЗмНС -

jOP

135

ai

30

J 44lV

-, - M4

61L

380

- JO

зС

106

265