Способ получения ДНК из биомассы еSснеRIснIа coLI Советский патент 1981 года по МПК C12N1/08 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДНК ИЗ БИОМАССЫ ESCHERICHIACOLI

I ; . ; ,

изобретение относится к химикофармацёвтической промышленности и касается получения ДНК, применяемой в исследовательской работе молекулярной биологии.

Известен способ получения дезоксирибонуклеинозой кислоты из биомассы Е. соИ путем обработки ее хлороформом с последующим удалением осадка, выделеиием из суперйатанта фагов в градиенте концеитраций хлористого цезия, освобождением из иих ДНК с последующей очисткой и осаждением целевого продукта 1.

Однако известный способ длителен (40 ч) и выход целевого продукта незначителен (0,32 Ml ДНК/1 г биомассы).

Целью изобретения является повышение млхода целевого продукта и ускорение способа.

Эта цель достигается тем, что по способу получения дак из биомассы Ё. ооИ путем обработки ее хлороформом с последующим удалением осадка, выделения из супернатанта фагов в градиенте концеитраций хлористого цезия, освобождения из них ДНК и очйстктв целевого продукта, фаги после выделения очищают диализом против трис-буфера, содержащего 0,05 М NaCI и 0,01 М. ЕДТА, при рН 7,9, освобождение ДНК {цюводят додецилсульфатом, а очистку осуществляют фенолом К смесью хлороформа с амиловым спиртом, взятых в соотншиении 24:1.

Способ осуществляют следующим образом.

Полученный осадок суспендируют в 0,01 М трис-буфере, рН 7,9 - 5,0+10% хлороформа. Очистку фага лямбда проводят в градиенте ,

to CsC. Полученную фракцию фага диализируют 2 ч против раствора, состоящего из 0,05 М Nad. 0,01 М раствора трис, рН 7,9, 0,01 М ЁДТА. Лизис клеток фага проводят додецилсульфатом иатрия. Депротеинизацию ДНК

IS проводят фенолом со смесью хлороформ - изоамиловый спирт (24:1), ДНК осаждают спиртом.

Пример 1. 13 г биомассы суспен.дируют в 45 мл 0,01 М трис-буфере, рН 7,9-

.$,0, добавляют 4,5 мя хлороформа, выдерживают 20 мии при 37°С, потом охлаждают до 4 С. Центрифупфуют 15 мин при 15000 об/мин. Очистку фага проводят в 33 мл градиента CsC (d 1,4; d 1,5; d 1,3). Осадок центрифуТируют. Полученную массу фага диализируют 2 раза по часу против 2 л буфера, содержащего 0,05 М NaCI, 0,01 М трис, рН 7,9, 0,01 М ЕДТА-Na. К массе фага прибавляют 3,5 мл 10%-ного додецилсульфата натрия. Раствор нагревают до . Для удаления белка к раствору, содержаще фаговый ДНК, прибавляют фенол. Осадок центрифугируют. Операцию повторяют, к центрифугату прибавляют равный объем смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1). Осадок центрифугируют. К раствору прибавляют 2 объема этилового спирта. Выход 0,4 мг лямбда ДНК/1 г биомассы. Качество: Д 260/Д 280 1,8. Пример 2. Юг биомассы суспендиру ют в 45 мл 0,01 М трис-буфере, рН 7,9-8,0, добавляют 4,5 мл хлороформа, выдерживают 20 мин при 37°С, потом охлаждают до 4°С. Центрифугируют 15 мин. при 15000 об/мин. Очистку фага проводят в 33 мл градиента CsCI (d 1,4; d 1,5; d 1,3). Осадок центрифугируют. Полученную массу фага диализируют 2 раза по часу против 2 л буфера, содержащего 0,05 М NaCI, 0,01 М трис, рН 7,9, 0,01 М ЕДТА-Na. К массе фага прибавляют 3,5 мл 10%-ного додецнлсульфата натрия. Раствор нагревают до 48° С. Для удаления белка к раствору, содержаще му фаговый ДНК, прибавляют фенол. Осадок центрифугируют. Операцию повторяют. К цент фугату прибавляют равный объем смеси хлороформ-изомиловый спирт (24:1). Осадок центрифугируют. К раствору прибавляют 2 объема этилового спирта Выход 0,4 мг лямбда ДНК/1 г биомассы. I Качество: Д 260/Д 280 1,8. Предложенный способ позволяет увеличить выход ДНК на 20% и сократить длительность процесса до 9 ч по сравнению с известным (40 ч). Ожидаемый экономический эффект 200000 руб/на 1 кг ДНК. ормула изобретения Способ получения ДНК из биомассы Escherichia coli путем обработки ее хлороформом с последующим удалением осадка, выделения из супернатанта- фагов в градиенте концентраций хлористого цезия, освобождения из них ДНК и очистки целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и ускорения способа, фаги после выделения очищают диализом против трис-буфера,содержащего 0,05 М NaCI и 0,01М ЕДТА, при рН 7,9, освобождение ДНК проводят додецилсульфатом, а очистку осуществляют фенолом и смесью хлороформа с амиловым спиртом, взятых в соотношении 24:1. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. М. Thomas and R. W, Daves. Studies on the cleavage of bacteriophage lambda Dvva with E. cori Restriction Endonuclease G. Md. Siol. 1975, v. 91, p. 315-328.