Способ определения активности L-глутаматдекарбоксилазы в биологической пробе Советский патент 1982 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагно tики и контроля за результатами лечения заболеваний неромой системы. Известен способ определения активности Й-глутаматдекарбоксилазы в биологической пробе путем гомогенизации lee в фосфатном буфере с последующим вне сением в гомогенат пиридоксальфосфата и глутаминовой кислоты,инкубации его, обработки кислотой, отделения образовавшегося осадка и добавления нингидрина t IОднако известный способ не обеспечивает высокой точности и чувствитель ности способа. Цель изобретения - повышение точности и чувствительности способа. Эта цель достигается тем, что в способе определения активности Е-глутаматдекарбоксилазы в биологической пробе путем гомогенизации ее в фосфатном буфере с последующим внесением в гомогенат пиридоксальфосфата и глутаминовой кислоты, инкубации его, обработки кислотой, отделения зовавшегося. осадка и побавпрния нингидрина,гомогенат после инкубации обрабатывают хлорной кислотой, далее смесь нейтрализуют, после отделения осадка супернатат хроматографируют на катионообменнике, имеющем 8% сшивки, о затем последовательно элюируют цитратным буфером с концентрациями 0,2 и 0,35 н.и после добавления в злюат нингидрина его колрриметрируют. Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. 100 мг ткани мозга гомогенизируют в Na-фосфатном буфере рН 6,4, содержащем тритон Х-100 и меркаптоэтанол. Затем часть гомогената термостатируН5Т с пиридоксальфосфатом, далее добавляют Е-глутаминовую кислоту и повторно термостатируют. Остановку энзиматической реакции и одновременно депротеинизацию смеси осуществляют добавлением хлорной кислоты. Центрифугированием отделяют денатурирова™ иные белки, снижают кислотность супернатата до рН 2,2 гидратом окиси алия.Выпавшие перхлораты калия удаля ют центрифугированием,а супернатат за гружают на аналитическую колонку с катионитом в Uei--0opMe. Затем элюируют вначале цитратным буфером рН ,25 для снятия с ионообменника кислых и нейтраль|ных аминокислот, а затем цитратным буфером рН 5,28 для выделения пика ГАМК на мл. Гаммааминомасляная кислота ГАМК определяется нингидриновым методом. Количест во ГАМК, образовавшееся в процессе энзиматической реакции, определяют путем вычита1-|ия ГАМК, находящейся в гомогенате ткани до энзиматической реакции. П р и м е р 1. 100 мг ткани головного мозга, полученной во время операций у людей или после декапитации животных, по возможности мгновенно помещают в алюминиевой, фольге или стеклянной кювете на холод (в сухой лед ). Выделенные для исследования кусоч ки ткани в замороженном состоянии быстро взвешивают и затем гомогенизируют в стеклянном микрогомогенизаторе на ледяной бане при 0°С в 0,025 н.фосфатном буфере рН 6,,содержащем % тритона Х-100 и 1,5 мМ меркаптоэтанола. На 100 мг ткани берут для гомогенизации 1 мл буфера. Затем берут две порции гомогената по 0,107 мл (этот объем содержит 10 кг ткани.) в две пробирки. Одна пробирка предназначена для определе ния фонового содержания ГАМК в 100 ткани, другая - для проведения энзиматической реакции. В каждую пробирку приливают по 1,9 мл 0,025 н.фосфаТного буфера рН 6,4, содержащего 1% тритона Х-100, 1,5 мМ меркаптоэта нола и 0,2 мМ пиридоксальфосфата. Затем пробирки термостатируют при 37°С в течение 20 мин при постоянном встряхивании. В этот период происходит насыщение глутаматдекарбоксилазы кофактором. Далее в фоновую пробивку приливают О ; 15 мл 8 Н.НС104И 0,5 мл 1 М фосфатного буфера рН б,, содержащего 80 мМ/мл глутаминовой кислоты, встряхивают и оставляют при комнатной Уемпературе. В другую пробирку приливают только 0,5 мл 1 М фосфатного буфера рН 6, А, содержащего 80/д,М/мл глутаминовой кислоты, встряхивают и инкубируют повторно при в течение Зи мин для проведения энзимэтической реакции. Энзиматическую реакцию останавливают добавлением 0,15 мл 8 н НСЮ,. После этого обе пробирки центрифугируют 20 мин при 10000 g для осаждения денатурированных белков. Надосадочную жидкость количественно переносят в чистые пробирки и рН смесей доводится до 2,2 с помощью 0,1 мл 10 н КОН и 0,3 мл 1 н КОН под контролем рН-метра. Выпавшие в осадок перхлораты центрифугируют при и 10000 g 10 мин. Надосадочную жидкость осторожно собирают и помещают в аналитич скую колонку с Аминекс в Na -фор- ме, уравновешеннуюо,2 н цитратным буфером рН А,25 (объем ионообменника 0,6x8 CMJ. Хроматографию осуществляют при 50°С. После полного всасывания надосадочной жидкости начинают элюцию 15 мл 0,2 н цитратного буфера рН ,25 под давлением 1-2 атм (скорость элюции 60 мл/ч}. Эта элюция снимает кислые и нейтральные аминокислоты, но ГАМК остается на ионообменнике. Этот элюат выбрасывают. Затем на колонку помещают 0,35 н цитратный буфер рН 5,28. Этот элюат собирают фракционно по 1 мл, пик ГАМК выходит на 17-18-ом мл элюции (т.е. на 23-ем мл второй элюции). После этого в каждую пробирку, содержащую по 1 мл элюата, приливают по 0,5 мл нингидринового реагента, накрывают алюминиевым колпачком и 20 мин нагревают на кипящей водяной бане. После охлаждения пробирок до комнатной температуры в них добавляют по 2 мл 50 -ного раствора этилового спирта и колориметрируют при нм (на фотоколориметре устанавливают зеленый фильтр. Активность глутаматдекарбоксилазы рассчитывают по количеству ГАМК,образовавшейся в результате энзиматической реакции в Дм/г ткани за 0,5 ч. Калибровочные опыты выполняют следующим образом. В 1 мл 0,2 к цитратного буфера рН 2,2 на колонку помещают 0,3 f ГАМК и по вышеописанной схеме выполняют хроматографию. Колебания величин экстинкций в разных калибровочных опытах в пределах %.

Активность ГДК в/л,(/г ткани ГАМК, образовавшейся за 0,5 ч энзиматической реакции равна:

(эеф)-0ь е,-о.о

ЕЭ экстинкция пика ГАМК, полу- О ценная после энзиматической реакции;

6ф - экстинкция пика ГАМК в фоно вом опыте;

0,3 - количество иМ ГАМК, помещаемое на колонку в калибровочных опытах; §„ - средняя экстинкция пика

ГАМК, получаемая в калибровочных опытах;

0,01 - количество ткани в г, взятое для энзиматической реакции. .

Данные предлагаемого способа активности глутаматдекарбоксилазы в различных огластях головного мозга белых крыс IS - 0,88 представлены в таблице.

Гиппокам, миндалина и височная доля

В отличие от известнЬго предлагаемый способ при той же чувствительности более специфичен, не требует специального помещения, оборудования и меченых реактивов, которые не только дороги и требуют осторожности в работе,но и потому, что биохимические реакции с их использованием идут иначе, нежели в естественных условиях.

Предлагаемый способ не зависит от колебаний температуры и давления, по сравнению со способами определения активности ГДК по выделению газообразного COjj, объем которого находится в прямой зависимости от этих величин.

предлагаемый способ позволяет определять не только активность ГДК, но и то количество ГАМК (про5дукта этой реакции), которое при- сутствует в ткани в свободном состоянии. Это позволяет делать чрезвычайно важные выводы об интенсивности функционирования ГАМК-ергической

O медиаторной системы.

Предлагаемый способ недорог, относительно прост, доступен, безвреден, использует широко распространенные отечественные реактивы и обоSрудование, не требует специального помещения и дополнительной подготовки персонала, потому может быть внедрен как в экспериментальную биои в практическое здрайологию, так охранение.

Формула изобретения

Способ определения активности Е-глутаматдекарбоксилазы в биологической пробе путем гомогенизации ее в фосфатном буфере с последующим внесением в гомогенат пиридоксальфосфата и глутаминовой кислоты, инкубации его, обработки кислотой, отделения образовавшегося осадка и добавления нингидрина, отличающийся тем, что, с целью повыше,ния точности и Чувствительности способа, гомогенат после инкубации обрабатывают хлорной кислотой, далее смесь нейтрализуют, после отделения .осадка супернатат хроматографируют н катионообменнике, имеющем 8% сшивки, затем последовательно элюируют цитратным буфером с концентрациями 0,2 и 0,35 н, и после добавления в элюат нингидрина его колориметрируют

Источники информации, принятые во внимание при экспер изе 1. Lov-ю I.P. Robins Е Egeman G.S 7h fluorirretric measerment of glutamic decarboxylase and its distribition inbrain J of Neurochem, 1958, T. 3,N 1, c. 8-18.