Способ определения активности фенилаланингидроксилазы в биологическом материале Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 

(5-) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

I

Изобретение относится к медицине и может найти применение в клинической биохимии для диагностики фенил- кетонуриии и для выявления гетерозиготных носителей гена фенилкетонурии.

Известен способ определения активности фенилаланингидроксилазы в биоптате печени. Способ заключается в том, что биоптат гомогенизируют в растворе, содержащем 0,01 И трисгидрохлорида, 0,15 М хлористого калия, 0,01 М бета-меркаптоэтанола, рН гомогенат центрифугируют, полученный супернатант смешивают с 0,17 ntfi раствором птеридинового кофактора и 1 mt-1 раствором фенилаланина (соотношение белок : кофактор : : субстрат 1-6:0,1:0,66), инкубируют смесь при 25®С в течение 15 мин, затем спектрофотометрически определяют количество окисленного птеридинового кофактора. Количество последнего эквивалентно содержанию новообразоФЕНИЛАЛАНИНГИДРОКСИЛАЗЫ

ванного тирозина и, следовательно, активности фенилаланингидроксилазы l .

Недостатком известного способа является его низкая чувствительность и поэтому он применяется только для определения активности фенилаланингидроксилазы в тканях с высокой активностью этого фермента.

Цель изобретения - повышение

10 чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении способа определения активности фенилаланингидроксилазы в биологическом материаISле путем его гомогенизации в растворе, содержащем трис-гидрохлорид, хлористый калий, бета-меркаптоэтанол, центрифугирования, инкубации супернатанта с раствором птеридино30вого кофактора и фенилаланина и последующей спектрофотометрии, отличительной особенностью является то, что гомогенизацию проводят в при3сутствии детергента тритон-Х-100, инкубирование осуществляют при соотношении белок : кофактор : субстрат как ,8:3,3 и спектрофотометрируют на этапе постоянной скорости ферментативной реакции. Способ осуществляется следующим образом, П р и м е р 1, В одну из кювет автоматического анализатора скоростей ферментативных реакций LKB-8600 помещают 50 мкл гомогената лейкоцитов, содержащего 15,.2 мг/мл белка (его концентрацию определяют прямой спектрофотометрией зкстинкции водородными связями белка при 210 нм), 1 мл 0,1 М раствора трис-гидрохло- . рида, рН 1 fk, содержащего 5 Jnf фенИл аланина, В контрольную кювету вносят 1 мл 0,1 М раствора трис-гидрохлорида. После помещения кювет в прибор с помощью автоматического дозатора в них добавляется по 50 мкл 0,85 М раствора кофактора (6,7-диметил-2амино-4-гидрокси-5,6,7,8-тетрагидро птеридин) и измеряют оптическую плот ность анализируемой пробы .сравнительно с холостой пробой (без субстрата) а течение первых двух минут реакции при скорости протяжки бумаги в регистрирующем устройстве б см/мин. Затем проводят расчет с помощью полученной кинетической кривой, где используется ее прямолинейныи участок, характеризующий постоян „ г. ную скорость изучаемой реакции. Рассчитывают величину оптической плотности за единицу времени и производя расчет величины удельной активности фермента по формуле

ДЕ-У

А

VA

- величина прироста экстинкции за 1 мин - общий объем реакционной

смеси - 1,1 мл;

- об1зем добавленного гомогената 0,05 мл;

- молярный коэффициент экстинкции для окисленной формы птеридинового кофактора - 6,45;

- концентрация белка в гомогенате в- мг/мл.

оси абсцисс выбирают интерваи bj, соответствующие 1-й-мин длиной в 3 см), по оси ординат

Формула изобретения

Способ определения активности фенилаланингидроксилазы в биологическом материале путем его гомогениза;ции в растворе, содержащем трис:гидрохлорид, хлористый калий, бетамеркаптоэтанол, центрифугирования, инкубации супернатанта с растворами птеридинового кофактора и фенилала нина и последующей спектрофотометрии отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, гомогенизацию проводят в присутствии детергента тритона Х-100, инкубирование осуществляют при соотношении белок : кофактор : : субстрат как 1-6:0,8:3,3 и спект0отсчитывают соответствующие величины экстинкции Е и Ел (размерность в оптических единицах указана на сетке на бумаге). Тогда в данном примере А ...ХЗР - 28) Ы 0,45 мЕ/мг VA 15,2 или 0,5 нМ тирозина за минуту на 1 мг белка гомогената. Пример 2. Гомогенат печени мыши. Скорость движения бумаги 6 см/мин, поэтому на оси абсцисс отсчитывают по 6 см (отрезки Ы) Концентрация белка в гомогенате 30,0 мг/мл. Производят расчет Е и Е и вычисляют Ауд . - 2П -Ы , VA ,5- 30,0 2,16 мЕ/мг или 2,1 б нМ/миНМГ белка. Способ по изобретению позволяет повысить чувствительность определе Д° нМ тирозина/мин.мг белКЗ, что позволяет определять активность фенилаланингидроксилазы в лейкоцитах человека, составляющую в среднем 1 нМ тирозина/мин мг белка, тогда как с помощью известного способа активность вообще не определяется. Таким образом, на этом биологическом объекте способ оказывается чувствительнее известного способа не менее чем в 100 раз. Предлагае „ - м . к « мыи способ может быть использован для определения фенила аиингидроксилазы в биологических материалах с низким содержанием этого фермента.

5932tpO6

рофотометрируют на этапе постоянной f 1. Ayling J., Pirsoi R., et all. скорости ферментативной реакции. A specific kinetik assay for pheИсточники информации, nylalanine liydroxylase. - Aralyt. принятые BO внимание при экспертизе Biodien, 1973, v. 51, p. 80-90.