Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой способ конструирования штам мое gscherichia coli, несущих плазмиду с генами рестриктазы и метилазы Е СО R II. Известны высокоспецифические рестрикционные эндонуклеазы и модицируют цие метилазы, которые широко используются для физического картирования хромосом, определения первичной струк туры ДНК, выделения генов, а также в экспериментах по генетическому конст.руированию tn vitro. Микробная клетка содержит в себе многочисленные как экзо- и эндонукг леазы, так и модифицирующие метилазы. Ферменты рестрикции - модификации Е со R И относятся к разряду эндонуклеаз и метилаз. Известен способ конструирования штаммов-продуцентов таких ферментов, закл0це1ющийся в том,чтоплазми|ду с feнами рестриктазы и метилазы Е со R ГТ путем коньюгации переносят в штамм Escherichia coli. Таким образом получают штаммы продуценты ферментов Е со R II 1. Однако полученные таким образом штаммы содержат интерферирующие ферментативные примеси. Поэтому обнаружение и вьщеление ферментов Е со R И на фоне других внутриклеточных интерферирующих ферментативных активностей весьма затруднено. Цель изобретения - повышение штаммов - продуцентов, не содержащих интерферирующих ферментативных примесей. Для достижения цели используют |итамм Escherichia coli. В 834, а в качестве плазмиды используют плазмиг ду N 3 или R 2kS. Штамм Е. coli В 83 (rj, mj) не содержит ни рестрикционной эндонукг леазы Е со В, ни модифицирующей метилазы Е со В, ни ДНК-цитозин-метилазы, характерной для штамма Е. coli НВ1100 2, По предлагаемому способу были полу чены 2 штамма. Штамм Escherichia coli В 83 (rg, , Л1р /R характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Клетки прямые палочковидной формы (1,1 1,5) (2,0 - 6,0) мк, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Культуральные признаки. Хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясо-пептонном агаре, питательном агаре Дифко, минимальном агаре Девиса с глюкозой и казаминовыми кислотами колонии гладкие, лые, прижатые, блестящие, серые, край ровный, мутные (на синтетических средах - более слизистые и мутные). При росте в жидких средах: мясо-пептонном бульоне, бульоне Дифко,г минимальной М9 с глюкозой и казаминовыми кислотами образуют ровную, интенсивную муть. Физиолого-биохимические признаки. Растет в пределах 4-45°С при оптимум рН 6,8-7.5. В качестве источника углерода используют многие углероды, спирты, органические кислоты, в частности d-глю козу, d-фруктозу, сахарозу, арабинозу ксилозу, лактозу, трогалозу. Не усваи вает ацетат, аданит, галактозу. В средах с глюкозой активно подкисляет с образованием газа. В качестве источника азота используют как минеральные .соли в аммонийной и нитратной форме, так в органической форме в виде пептона, аминокислот. Нитраты восстанавливает до нитритов. Желатину не разжижает. Уреазная активность не обнаруживается... И ДО-П не образует. Устойчивость к антибиотикам. являет устойчивость к тетрациклину (30 мкг/мл). Штамм Escherichia coli В 83 (г, m)/N 3 характеризуется теми же морфо логическими, культуральными и физиоло гобиохимическими признаками. Устойчивость к антибиотикам. Прояв ляет устойчивость и стрептомицину (30 мкг/мл), сульфаниламиду (250 мкг/мл), и тетрациклину (ЗОмкг/мл П р и м е р 1. В 100 мл мясо-пептонного бульона вносят 1 мл культуры 4 Ё. coli В 83 и выращивают до плотуости 0,4 (ФЭК, светофильтр 6, кювета 0,5 см). После охлаждения клетки собирают центрифугированием и ресуспендируют в равном объеме 10 мМ NaCl, После 20-минутной инкубации во льду клеткисобирают центрифугированием и ресуспендируют в 1/2 объема 75мМ . Клети инкубируют 20 мин и вновь собирают центрифугированием. Осадок ресуспендируют в 1 мл 75 мМ СаСРз.. К 0,2 мл суспензии полученных клеток добавляют 0,1 мл ДНК плазмиды R , инкубируют во льду 20 мин. Затем смесь подвергают 2- минутной обработке при и выдерживают 15 мин при 2k С. Смесь разбавляют в 10 раз бульоном, подращивают клетки 30 мин при , отбирают на 0,1 мл суспензии и высевают на чашки с питательным агаром, содержащие ЗОмкг/мл тетрациклина. Выросшие клетки Е. coli В 83 (гг, Ша)/И растят до поздче ней логарифмической фазы в питательном бульоне Дифко. Клетки собирают центрифугированием бООО g, до 20 мин и ресуспендируют в буфере следу.ющего состава: 0,01 м К-Р04, рН 7,01 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 5% глицерин. Клетки разрушают ультразвуком. После разрушения центрифугируют 100000 g, 1 ч при С. Бесклеточный экстракт содержит ферментативную активность. П р и м е р 2. Трансформируют плазмиду N в штамм Е. coli В (Г0, mg) и получают бесклеточнь1Й экстракт из сконструированного штамма Е. coli В 83 (г, mp/N 3 аналогично описанному в примере 1 . , Определение активности ДНК-метилаз. Активность метилазы определяют в реакционной смеси общим объемом 150 мкл, содержащей 0 мМ К-РО, рН 7,8, 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 20 мкг ДНК спермы лосося, мкМ/метил-ЗН/S - аденозилметионина и 50 мкл бесклеточного экстракта. Реакцию проводят при в течение 1 ц, добавляют равный объем 0,75 N едкого натра, инкубируют 30 мин при . Затем к пробам добавляют 2 мл холодной 5%-ной трихлоруксусной кислоты. Осажденную ДНК наносят на фильтры, промывают 0,01 N НС1 и спиртом. После просушки фильтров определяют радиоактивность . Для определения специфичности включения метки в азотистые основан ДНК последнюю элюируют с фильтррв, гидролизуют до азотистых оснований хлорной кислотой и основани разделяют хроматографией на бумаге. Определяют местоположение оснований на хроматограмме в проходящем УФ-св те, вырезают пятна, соответствую 1цие разным основаниям и определяют в них радиоактичность. Формула изобретения Способ конструирования штаммов Escherichia coli - продуцентов рестриктазы и метилазы Е со R II, вклю36Чающий трансформацию плазм ды, имею щей гены рестриктазы и метилазы Е со R II, в клетки Escherichia со . 11, отличающийся тем, чтб, с целью получения штаМмов-Продуцентов, не содержащих интерферирующих ферментативных , используют штамм Escherichia coli В бЗ, а в качестве плазмиды используют плазмиду N 3 или R 2k5. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Бурьянов Я, И. и др. ДАН СССР, 1977. т. 237, , с. k65-(Q 2.Wood W. В., J, Мо1. Biol, V, 16, 1966, р. 118-133.
