Штамм еSснеRIснIа coLI в834 ( @ , @ ),несущий плазмиду RSF 2124,-тест субстрат для рестрикционной эндонуклеазы ecoR11 Советский патент 1982 года по МПК C12N1/02 

(54) ШТАММ ESCHERiCHiA COli В834 (r . т ), НЕСУЩИЙ , ПЛАЗМИДУ RS F2I24-TECT-СУБСТРАТ ДЛЯ РЕСТРИКЦИОННОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ЕСО R 11

1

Изобретение относится к микробиолопсческой промь1шленности и представляет собой штамм Escherichia coli, несущий плазмиду, используемую как тест.-субстрат для определеиия активности фермента при вьщелении и очистке рестрикционной эндоиукяеазы Есо В 11, которая используется в молекулярной биологии и генной инженерии.

Одиим из последних достижений молекуляриой биологии в последнее время является создание методов, которые позволяют получать рекомбинантные ДНК in vitro.

Рестрикциоиные эндоиуклеазы стали мощным инструментом при создании рекомбинантиых ДНК in vitro, а также для излучения первичной структуры и физического картирования ДНК. Позтому прогресс в молекулярной биологии и генной инженерии обусловлен прогрессом в области изучения и выделения ферментов рестрикционных зндопуклеаз.

Среди рестрикционных зндонуклеаз, особое место занимает рестрикционная : ндонуклеаза Есо R II, которая узнает последовательность 5 ЦЦ ГГЗ (1.Однако рестриктаза Есо R 11 - это мелкощепящая зндонуклеаза, ДНК фага лямбда, она расщепляет iSortee чем на 35 фрагментов, в то время как другая широко используемая рестриктаза Есо R 1 -на 6 фрагментов.

Таким образом, при выделении и очистке Есо R 11 практически невозможно оценить активность электрофорезом при использовании ДНК фага лямбда. Множество фрагментов, образующихся при гидролизе ДНК фага лям10бда рестриктазой Есо R 11, не дает ясной картины о степени гидролиза ДНК.

Для определения активности Есо R 11 требуется ДНК-субстрат с небольшим молекулярным весом, иа роль такой ДНК могут

15 подойти ДНК плазмцц.

Такими ДНК-субстратами могут быть ДНК амплифицируемых, дающих множество копий ДНК на клетку, плазмид, например известная плазмида RS F2124, молекулярный

Ш вес 7,4 мегадальтон 2.

Однако эти плазмидные ДНК находятся в штаммах Е. coli К, которые имеют специфический фермент ДНК-цитозин метилазу. Фермент MCTHJtHpyeT iiHioimi н JUIK и 1аким образом пеласг JIMK irjiaiMwi устойчивым к действию р -стрик1шоииой )нлонуклса)ы Fko R 11 3. Поэтому плагмнды, находящиеся в этих штаммах, нг могут служить субстратом для 1;х:о R П. Лля этих целей лриюдны ДНК, если они выделены н) штамма, не содержаще го ДНК-11Итоз шмстилазу. Предлагаемый титамм характеризуется следующими признаками. Мор }ю;101ические признаки. Клегки прямы .налочкопидной формы, 1,1-1,5x2,0-6,0 мк, подвижные с перитрихиальными жгутиками, I рамотрикательные, неспороносные. Культуральные признаки. Хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясо-пептонном агаре, питательном агаре Лифко, минимальном агаре Дэвиса с глюкозой и казаминовыми кислотами - колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, серые край ровный, мутные (на синтетических средах -- более слизистые и мутные). При росте в жидких средах: мясо-пептонный бульон, бульон Дифко, минимальный М9 с глюкозо и казаминовыми кислотами образуют ровную интенсивную муть. Физиолого-биохим}р4еские признаки штамм Растет в пределах от 4 до 45С при оптимум рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника углерода использует многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности d-глюкозу, d-фрукгозу, сахарозу, арабииозу, ксилозу, лак тозу, трегалозу. Пс усваивает адетат, адамит, галактозу, в средах с глюкозой активно подкисляет с образованием газа. В качестве источника азота используют ка минимальные соли в аммонийной и нитратной форме, так в органической форме в виде пеп тона, аминокислот. Нитраты восстанавливает д нитритов. Желантину не разжижает. Уреазная активность не обнаруживается. Индол не образует. Проявляет устойчивость к антибиотикам - ампициллину (25 мкг/мл). Пример 1. Выледение плазмидной ДНК. Клетки, содержапще плазмиду, выращиваю в 5(Ю мл бульона до плотности 0,6 (ФЭК. светофильтр № 6, кювета 0,5 см). Затем клетки собирают центрифугированием (6000 20 мин), суспендируют в 4 мл 25%-нойг сахарозы в 50 мм трис-НС1, рН 3,0, иобавляки 1,2 мл лизогшма (10 мг/мл) и 1шкубир ют 10 мин во льду при перемешива К смес-и добавляют 2,4 мл 0.25 М ЭДТА (рН 8.0), оставляют во льду на 10 мии, а мтгм доГпнпяни последовательно 2,6 мл 5М pacrnnria NaCI и 1,2 м.л 10%-ного раствора одецилсульфата нагрия, шжубируюг во льду в течение 5-7 ч. Осветле1гаые лизаты получают центрифугированием смеси при 16000 д в течение 1 ч. К экстрактам добавляют CsCl из расчета 0,94 г на I мл и бромид этидия до конечной кондонтрации 200 мкг/мл. Полученную смесь центрифугируют при 44000 об/мин в течение 40 ч в роторе Ti 50. Нижнюю, прокрашенную бромистым этидием зону, собирают по каплям, прокалывая пробирку под зоной. Бромид этилия удаляют 2-х кратной экстракцией изопропиловым спиртом. Полученную ДНК диализуют против 10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 20 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА. Пример 2. Трансформация плазмидиой ДНК. В 100 мл бульона вносят 1 мл культуры Е. coli В834 и выращивают до плотности 0,4. После охлаждения клеток собирают центрифугированием и ресуспендируют в равном объеме 10 мл NaC1. После 20 мин инкубации во льду клетки собирают центрифугированием и ресуспендируют в 1/2 объеме 75 мМ CaClj. Клетки инкубируют 20 мин и вновь собирают центрифугированием. Осадок рс(.успендируют в I мл 75 мМ Са Clj. К 0,2 мл суспензии полученных клеток добавляют 0,1 мл ДНК плазмиды RS F2I24, инкубируют во льду 20 мин. Затем смесь подвергают 2 мин обработке при 42°С и выдерживают 15 мин при , Смесь разбавляют в 10 раз бульоном, подращивают клетки 30 мин при 37 С и отбирают по 0,1 мл суспензии, затем высевают на чашки с питательным агаром, содержащим 25 мкг/мл ампициллина. Пример 3. Определение активности рестрикционной эндонуклеазы Бсо R 11, К 1 мкг ДНК в буфере, содержащем 50 мМ трис-НС1 , рН 7,5, 10 мМ MgClj, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ ЭДТА, добавляют 5 мкл эндонуклеазы Есо R 11, общий объем смеси составляет 40 мкл. Гидролиз ведут при 37°С в течение 15 мин. Полученные фрагменты ДНК анализируют с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном пластиичатом геле в трисацетатиом буфере, рН 8,0. Предалагемый штамм, несущий плазмиду, которая может быть использована в качестве тест-субстрата для рестрикционной эндонуклеазы Есо R 11, обеспечивает возможность определения и оценки активности фермента не только очищенного, но и в грубых экстрактах. Формула изобретения Штамм Escherichia coli В834 (r , гп), несущий плазмиду RS Р2124-гест-субс1рэг для рестрикционной эндонуклеазы Есо R It.

5 908793, д

Хранится во Всесоюзной коллегии мккро- I. Bigger С. Н. et. ai. rattir New Bloloорганизмов при Институте биохимии и физио-jy. 1979, v. 244, p. 7-10.

логии микроорганизмов АН СССР под номером2. Sfe М. et. a1. Mol. Gen. Genetic. 1975

ВКМВ-1442Д.V. 142, p. 239.

Источники 1шформащш,5 3. Гусейнов О. А. к др. Биохимия, т. 43.

принятые во внимание при экспертизе1978. 1718 (прототип).