Штамм еSснеRIснIа coLI в 834 ( @ @ )/PBR 322 Советский патент 1982 года по МПК C12N15/00 

I - : ,

Изобретение относится к ми обиопогвческой промьпаленности ИПредставпяет собой ш аммEscheHcliia соЕл f опазмиду, используемую как Tediv субстрат для определения активности фермента при выделении и очистке рес1ь. рвкпвоЕШС экдонукпеааы Бсо ЯН., которая . вспользуется в молекулярнсй) биоаогив .В генной инженерии.

Рес1рикционные эндонуклеазы ctahtr мощным инструментом 11ри создш ии ре комбинать к ДНК Iw vitiro ,: а также дня изучения первичной структуры и фвзвческого картврюания/ШК. Поэтомупрогресс в молекулярной биологии и гераней инженерии обусловлен nporpeccoNi в области изучения и выделения фермент(ю-рестрвкцишных эндшуклеаз.

этих рестрикционных эндонук леаз, особое место занимает эндснукпеаза Есо R. , которая узнает последова-г тельностъ 5 ЦЦ ГГ. з tl .

Эта 1рестрикционная эндон клеаза была открыта и описана с помощью метода центрифугирования фрагментов взотопномеченнс фагов1 ДНК в градиенте концентрации сахарозы при определенвв активности фермента 12 .

Этот метод предполагает испопьзоёание в качестве тесть-субстрата меченный ДНК фага лямба, но процесс прпучвява и использования этого тестмгубстрата следует считать очень трудоемким в весьма неудобным.

10

В последнее время для тестврозайва реатриктаз наиболее широко используется метод электрофореза в полиакриламид ных и агарозных гелях. В качестве стан дартных тестмзубстратов в том случае

15 используют ДНК фага лямбда, ШЖ адено вируса 2 и вируса V 40. После гидролиза рестриктазой фрагменты ДНК фракцвовгвруют в геле, после электрофоретическсго разделения гель окрашивают бромистым

20 этидием и фрагменты ДНК визуализирую ютея при УФ освещении геля З .

Но рестриктаза ЕСО RR .. это мелкощепящая эндовуклеаза, ДНК фага лямбда ,3918 сиа расщепляет более чем на 35 фрагментов в то время как другая широко используемая рестриктааа Ёсо R1 на 6 фрагментов) . Таким образом, 1фи выделении R очвст ке Есо Rii практически невозможно с«енить активность электрофорезом при испопьасюании ДНК фага лямбда. Множестлво }ч5агменто©, образующихся при Гйдролвае ДНК фага лямбда рестиктазой tcoRff, не дают ясной картины о степени гидр лиза ДНК. Для определения активности EcoRff тре буется ДНК-субстрат с небольшим мопекул5фным весом, на роль так( ДН могут подойти ДНК плазмид. Такими ДНК-субстратами могут быть ДНК амплифидируемых, дающих множество копий ДНК на клетку, плазмид, например, хорошо известная плазмнда PRR 322, мол. вес 2,8 мегадальтсн 15 . Но этим плазмидные ДНК находятся в штаммах Е. coEi К, которые имеют специфический фермент ДНК-цитозин метилазу. Фермент метелирует цитозин в ДНК и делает ХШК плазмид устойчивым к действию рестрикцаонной эндшузклеа- зы Есо RH , riosTofviy гухазмйды, находящиеся в ЭТИХ штаммах не могут служить субстратом для tco R|. Для этих целей пригодны ДНК, если оиги выделены из штамма не содержащего ДНК-цитозин метилазу. . Цель изобретения - штамм E.coti, содержащий плазмиду Р RR 322, которая монсет быть использована для тирист рования активности рестракцишнсй эндон. нуклеазы Есо RJl. .; Штамм получен Путем трансформации плазмидыРВК322 в штамм E.CX)EiB834, который не содержит ДНК-цитозин метвл Предлагаемый штамм характеризуется следующими признаками. . , Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидной формы, 1,1-1,5V Х2,,0 мк, подвижные с перетрвхиаль ными жгутиками, грамотрицательные и несп ор(И осные. Культурные враанаки. Хорошо растут на простых питательных средах. росте на мяс(-пептоннсй«г , питательном агаре Дифко, минимальном агаре Дэвиса с глюкозой и казаминовыми квспотами - колонии гладкие, 1фуглые, прижатые, блестящие, серые, край ровный, мутные (на синтетических средах- более слизистые н мутные). При росте в ких мясо еитонный бульон, бульон Дифко, минимальная среда М9) с глюкозой и казаминовыми киспотакги образуют ровную, интенсивную муть. Физиолого-гбиохимические признаки. Растет в пределах.от 4 до при оптимум рН 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органичес кислоты, в частности: oL-глюкову, d-Фруктозу, сахарозу, арабинозу, ксилоЗУ, лактозу, трегалозу. Не усваивает ацетат, аданит, галактозу, В средах с глюкозой активно, подкисляет с офазова «ием газа. В качестве источника азота использует как минеральные соли в аммонийной и нитратной ффме, так и в органической , в виде пептона, амин(жислот. Нитраты восстанавливает до нитрвяздв. Желатину не разжи)кает. Появляется устойчивость к антибиотикi кам: тетрацюслину (30 мг/мл), ампотиллину (25 мг/мл). Пример. Выделение плазмидН1й ДНК. Клетки, содержащею п;|азмиду выращивают в 50Р мл бульона До плотности Oj6/5 10 клеток на 1 tai Затем клетки собирают центрифугщ)ованием (500О об/мин., 2О мин), суспенд уют в 4 мл 25%-ной сахарозы, в 50 мл трис-НСб, рН О,8, добавляют 1,2 мл лизоцима (Ю мг/мп) и инкубируют 1О мин. во льду tipa перемешвванви. К смеси добавляют 2,4 мл 0,25 М ЭДТА (рН 0,8), оставляют во льду на 10 мин, а затем добавляют послеаовательно 2,6 мл 5М р-ра NaCfc и 1,2 мл 1О%-нрго р-ра подецилсульфата натрия, инкубируют во льду в течение 5-7 ч. Осветленные лизаты получают центрифугирсшанием смеси 160000-в течение 1 ч. К экстрактам добавляют СеСЕ из расчета 0,94 г на 1 мл и бромид эгипия до конечной концентрации 200 мг/мл. Полученную смесь центрифугируют при 44ООО об/мин, в течение 4О ч в роторе Tj 5О. Нижнюю, прокрашенную бромистым этидием, зону собирают по каплям, прокалывают пробирку под зоной. Бромид этидия удаляют 2-х кратной экстракцией изопропиловым спиртом. Полученную ДНК диализуюг против 1О мм грйс-НСе , рН 7, 5, 20 мМ, Nace , 1 мМ ЭДТА. П р и м е р 2-. Трансформация плазмияной ДНК. В 100 мл бульона вносят 1 мл культуры E.COCi в 834 и выращивают до плотности 0,4. После охлаждения клеток собирают центрифугированием и ресуспендируют в равном объеме 1О мЛ1 МоСС ,, После 2О мин инкубации во льду клетки собирают центрифугированием и ресуспендируют в 1/2 объема 75 мМ СаСЧу Клетки инкубируют 20 мин- и вновь собирают центрифугированием. Осадок расуспедируют в 1 мл -75 мМ CaCt . К 0,2 мл суспензии полученных клеФок добавляют 0,1 мл ДНК плазмиды рвя 322, инкубируют во льду 20 мни. Затем смесь подвергают 2-ос минутной обработке при 42С и выдерживают 15 мви при . Смесь разбавляют в Ю раз бульоном, подращивают клетки 30 ми при 37 с и отбирают по 0,1 мл суспензий и высеивают на чашки с питательным агаром, содержащие 25 мг/мл ампициллЁна. Пример 3. Определение активное та рестрикцисиной эндо:нуклеазы Есо Ц-, К 1 мг /ЩК в буфере, содержащем 5О мМ ирис рН 7,5 10 мМ . , 10 мМ 2-меркаптоэтанап, 1 мМ ЭДТА, добаап пот of .0,1 до 5 мл эндснуклеазы ЕСО RH , общий, объем смеси 40 мл. Гидролиз ведут при 15 мин. Полученные фрагменты ДНК анализируют с «(МОЩЬЮ электрофсреза в агарозном пластинчатом геле в трис-ацетатном буфере (рН 8,0). Предложенный штамм, ялазмида из которого используется в качестве тест-субстрата для ресорвкционной эндонуклеазы ,позволяет получать тест-суб,страт, которъ1й может быть нспользюав для определения и ооенкв активности фермента как очищеннсго, так в грубых экстрактах. Формулаизобретёнвя Штамм E5cberic1lia Cogi В 834 (% WB /Р 22, № ВКМ В14411) (хранится во Всесоюзной коллекции ми1фоорганизмов прв институте бво- химии и физиологии микроорганизме АН СССР), используемый в качестве тест-субстрата для рестрвкционвой эндоч нуклеазы EcoR.n. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе l. cH-etaE. Nature Ысесцу. 1973, 244,7-10. 2.JoffWwioK R.N-,P1i-T)-Ttiesis,H971,OHiv. o CQiti ovY ia3. РЛ- et at-BiocVieYY istv. 1973, V.12. 3055. 4.Roberts R.D.crit.Rev.Biochevn., 1976, V.4, 133. 5.Bot.ivar Р...1917,У.2,95--иа1,6, Биохимия, 1978, т. 43, 1718.