Способ получения тимоцитарного антигена Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 

ср

ю to

оо

Изобретение относится к биологии и медицине. Оно может быть применено для получения антигена тимоцитов, используемого в экспериментальной и клинической биологии и медицине для получения антитимоцитарннх сывороток

Известен способ получения тимоцитарного антигена путем гомогенизации исходного сырья, выдерживания полученной суспензии клеток в инкубационной среде с последующими центрифугированием, диализом надосадочной жидкости и лиофилизацией целевого продукта 1. Однако известный способ трудоемок и не обеспечивает высокой чистоты целевого продукта.

Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта с одновременным упрощением способа.

Эта цель достигается тем, что при осуществлении способа получения тимоцитарного антигена путем гомогенизации исходного сырья, вьщерживания полученной суспензии клеток в инкубационной среде с последу мцими центрифугированием, диализом надосадочной жидкости.и лиофилизацией целевого -продукта предлагается в качестве исходного сырья использовать тимус, суспензию клеток выдерживать в изотонической среде при 44,5-45°С в течение 58-65 мин, диализ вести против дистиллированной воды и лиофилизацию проводить непосредственно после диализа.

Способ осуществляют в несколько этапов.

1.Получение клеток тимуса.

Сразу после забоя крыс тимус извлекают и помещают в охлажденную среду 199. Клеткой получают, используя стеклянный гомогенизатор со слабо пригнанным поршнем. Взвесь клеток (З-Ю в 1 мл) в среде 199 отмывают

центрифугированием (1500 об/мин) и ресуспендируют в исходном объеме.

2.Отделение антигена тимоцитов от клеток.

Ресуспендицированные тимоциты (концентрация бЮ клеток в 1 мл) нагревают в течение 1 ч при ..Прогретую суспензию клеток центрифугируют 10 мин (1500 об/мин). Надосадочную жидкость отбирают, помещают в целлофановые трубки для диализа и диализируют в течение 2 суток против дистиллированной воды. Содержимое трубок лиофилизируют.

Антитела из сыворотки получают путем осаждения глобулинов сульфатом аммония при 50%-ном насыщении.

Пол енный препарат обладает выраженной активностью тимического антигена. К полученному антигену тимуса крыс получают антитимоцитарную сыворотку, для этого в подушечки лап кроликов вводят адъювант Фрейнда (по 0,25-0,30 мл). Через 10 дней в подколенные лимфатические узлы вводят по 0,25 мл смеси антигена с адъювантом (15 мл сухого препарата антигена +0,5 мл физиологического раствора + 1 мл адъюванта). На иммунизацию одного кролика идет 7 мг сухого препарата. На 27-ой день получают иммунную сыворотку, которую испытывают на цитотоксичность и специфичность.

В табл. 1 приведены результаты этой оценки, в табл. 2 - для сравнения сыворотки, полученной по известному способу.

Как видно из приведенных в табл.1 данных, результаты проверки свидетельствуют о большой активности и специфичности исследуемых сывороток по отношению к тимоцитам.

Результаты, приведенные в табл. 2 подтверзкдают данные о специфичности и активности сыворотки, полученной по предлагаемому способу, которая не уступает по активности сыворотке, полученной по известному способу.

Проводят также реакцию торможения цитотоксической активности сыворотки, полученной по предлагаемому способу. Эту реакцию осуществляют смешиванием равных объемов сыворотки и препаратов тимоцитов и костномозговых клеток крыс (от 5x10 клеток). Инкубаты выдерживают в течение ночи и ставят реакцию. Результаты реакции торможения цитотоксичности антисыворотки представлены в табл. 3.

Как видно из всех приведенных таблиц, .результаты проверки полученных по предлагаемому способу сывороток указывают на их специфичность и активность по отношению к тимоцитам тех животных, из которых они были получены.

Использование предлагаемого способа не требует применения дорогостоящего оборудования и реактивов. Для приготовления антигенного материала можно использовать практически неограниченное количество клеток тимуса от любого вида животных и человек I

Получение антигена не требует разрушения клеток, что обеспечивает большую чистоту препарата.

Выделенный по предлагаемому способу антиген может быть использован для получения высокоспецифичной и высокоактивной сыворотки для экспериметальных и лечебных целей.

Активность и специфичность антитимоцитарноЙ сыворотки к клеткам крыс (по цитотоксическому индексу)

Таблица 1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ .ТИМОИИТАРНОГО АНТИГЕНА путем гомогенизации исходного сырья, выдерживания полученной суспензии клеток в инкубационной среде с последующими центрифугированием, диализом недостаточной жидкости и лиофилизацией целевого продукта, отличающийс я тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта с одновременным упрозением способа, в качестве исходного сырья используют тимус, суспензию клеток выдерживают в изотонической среде при 44, в течение 58-65 мин, диализ ведут против дистиллированной воды и лиофилизацию проводят непосредственно после диализа.

Раведение , Иитотоксический индекс сыворотки с тймическими клетками, 1 крол. J 2 крол. 291 . 91 468,1 82,4 8 6773,6 . Активность и специфичность к клеткам мышей (по цит Разведение Сыворотка сыворотки тимоцитами

Неабсорбированная сыворотка

Абсорбированная сыворотка

(печенью, эритроцитами)

Сыворотка по

4 8 методу Голуб

16 32 Цитот

15 12

64 62 52

5

41 44

7 6

36 39

9

31 37

8

24 Цитотоксический индекс с костномозговыми клетками, % 1 крол. 2 крол. 7,54,3 12 ,1 Таблица 2 антитимоцитарной сыворотки отоксическому индексу) оксический индекс,% со спленоци- с костнотами мозговыми клетками

942281

Торможение цитотоксичности антитимоцитарной сыворотки в присутствии 1 леточных препаратов

Т а 6 л и ц а 3