Штамм вируса клещевого энцефалита N139 для приготовления гемагглютинирующего инактивированного диагностикума Советский патент 1984 года по МПК C12N7/00 C12R1/91 

о

00

i Изобретение относится к вирусологии, а точнее к лабораторной диаг ностике заболеваний, вызываемых вирусом клещевого энцефалита. Известен штамм вируса клещевого энцефалита Софьин для приготовления гемагглютинируюп его инактивированного диагностикума tH и С21 . Однако известный не обладает достаточно выраженной антигенной и биологической активностью. Целью изобретения является новый штамм вируса клещевого энцефали та № 139, обладаквдий повышенной антигенной и биологической активность Штамм клещевого энцефалита № 139 выделен из клещей Yxodes persulcatu в классическом очаге клещевого энце фалита в июне 1979 года в Комсомоль ком районе Хабаровского края и хранится в коллекции Института вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР (депозит ГКВ № 639), Штамм вируса клещевого энцефалит № 139 характеризуется следующими признаками. Штамм высокопатогенен для беспородных взрослых и новорожденных белых мЕлпей. При заряжении вызывает типичную картину экспериме тального энцефалита с инкубационным периодом при внутримозговом заражении 4-5 дней (шах титр в log LD 50/мп 10,52-10,12, при подкожном и внутрибрюшинном 5-6 дней (max титр в log LD 50/мл 90,70-9,72 и 8,7-8,5 .соответственно). Индекс инвазивнос1ти 0,82-0,42. Гемагглютинирующая активность штамма при репродукции в мозге мы411ей 1:2560 - 1:10240 в зонах iph 6,0-7,0. Индекс инактивации штамма № 139 эфиром (в log LD 50/0,03) - 5,0} илдекс инактивации дезоксихолатом натрия 2,lj индекс терморезистентности 2,8. Штамм № 139 хорошо размножается перевиваемой культуре ткани СПЭВ, в .зыйая четкую деструкцию клеток на 4-5 сут. Пик накопления инфекционно и гемагглютинирующей активности отмечается на 5-ые сутки. Титр вируса культуральной жидкости на 5-ые сутк инкубации при 37°С составил 5,2 (в log LD 50/0,03). Штамм f 139 обладает высокой бляшкообразующей активностью, под агаровым.покрытием титр по БОЕ на культуре СПЭВ: 8,99,5 log БОЕ/МП. Титр по БОЕ коррелирует с показателеминтрацеребраль ной активности на мышах. Бляшки появляются на 4-ые сутки, гетерогенны S - признак 1,0-2,5 мм. Антиген, полученный из данного штб1мма, имеет максимальный титр в РГА до 1:10240. Штамм № 139 в реакции биологичес кой нейтрализации нейтрализуется гомологичными сыворотками и сыворотками к штаммам вируса клещевого энцефалита Софьин, Хабаровский-17, Абсеттаров. Индексы нейтрализации штамма № 139 с гомологичными сыворотками 3,3-3,0; с сыворотками к штамму Софьин 4,0-3,lJ с сывороткой к штамму Хабаровск-17 2,9-2,9; с сывороткой к штамму Абсеттаров 2,8-2,7. Антигенные свойства штамма изуче- . вы в перекрестной РТГА, РСК и в кинетической РТГА. Штамм № 139 обладает более высокой антигенной активностью по уравнению со штаммом Софьин, быстрее связывается с антителами и в 2-8 раз превышает по титру коммерческий антиген. В перекрестной РТГА с использованием гипериммунных сывороток выявлено тесное антигенное родство с западными и восточными штаммами вируса клещевого энцефалита и более высокая активность штамма № 139, который выявил антитела в сыворотках в 2-8 раза в более высоких титрах. Кроме того, выявлена хорошая активность антигена из штамма № 139 в РСК. В перекрестной РСК исследовали по 6 гипериммунных крысиных сывороток к штаммам № 139 и Софьин Средняя геометрическая титров антител в сыворотках при использовании штамма № 139 4,4; штамма Софьин 4,3 (средняя геометрическая логарифмов с основанием 2 ). В РСК с гипериммунной сывороткой кроликов к штамму Софьин титр при использовании антигена из штамма № 139 1:32, штамма Софьин - 1:16. Пример. Пассирование вирусов. Беспородных белых мышей весом 6-7 г заражают в мозг по 0,03 мл вирусной суспензии штамма № 139. При появлении выраженных параличей на 4-5 сут мЕллей забивают, извлекают асептично мозг и готовят 10%-ную суспензию мозговой ткани путем растирания мозга в ступке с добавлением физиологического раствора. Полученные мозговые взвеси центрифугируют при 1000-1500 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную взвесь отсасывают и используют для заражения партии мьшей, инфицированный мозг которых используется для приготовления антигена. Приготовление антигенов. Из полученных инфицированных мозгов готовят 10%-ную взвесь на ббратном буферном растворе с рН 9,0 и экстрагируют 24 ч при +4°С, затем взвесь центрифугируют на холоде при 9000.об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость обрабатывают протаминсульфатом из расчета 6-9 мг сухого препарата на 10 мл вирусной суспензии. Получинную взвесь помещают в холодильник при на 30 мин и затем центрифугируют 15 мин при 2000 об/м также на холоде. Полученную надосадочную жидкость - антиген инактивируют бетапропиолактовом 1:1000 в течение 30 мин при комнатной температуре (помешивая взвесь через 5-10 мин). Действие бетапропиолактона (через 30 мин гасят 14%-ным гипосульфитом натрия (на 10 мл антигена - 1,2 мл 14%-ного гипосульфита). Полученные таким образом антигены из мозга мышей методом боратносолевой экстрации, обработанные протаминсульфатом, инактивированные бетапропиолактоном, прюшедшие контроль безвредности на беспородных белых мышах, были использованы в РТГА в сравнительном титровании четырех групп сывороток. Были исследованы сыворотки доноров из Хабаровска, используемле для приготовления иммуноглобулинов, сыворотки людей, привитых очищенной, концентрированной вакциной против клещевого энцефалита/ сыворотки больных с диагнозрм клетевой энцефалит и т ипоспецифические иммунные сыворот0ки. В опыте, кроме зкспбриментальных серий антигена из штамма 139, был использован диагностикум клещевого энцефалита, штамм Софьин сер. 59.

Полученные результаты представле5ны в таблице (средние титры антител при испытании различных диагностикумов).

Италад вируса клещевого энцефалита 139, ГКВ 639 коллекция Института вирусологии АМН СССР им. Д.И. Ивановского, используемый для приготовления гемагглютинирующего инактивированного диагностикума. (Л