Штамм вируса клещевого энцефалита N132 для приготовления гемагглютинирующего инактивированного диагностикума Советский патент 1984 года по МПК C12N7/00 C12R1/91 

а: со

00 Изобретение относится к вирусологии, а именно к лабораторной диаг ностике заболеваний, вызываемых вирусом клещевого энцефалита. Известен штамм вируса клещевого энцефалите Софьин длГя приготовления гемагглютинирующего инактивированного диагностикума. Однако, известный штамм не обладает достаточно выраженной антигенной и биоло гической активностью / ijwizj. Целью изобретения является новый штамм вируса клещевого энцефалита 132, обладающий повышенной антигенной и биологической активностью. Штамм клещевого энцефалита 132 выделен из клещей.Ixodes persulcatu в классическом очаге клещевого энце фалита в июне 1979 года в Комсомоль ком районе Хабаровского края и хранится в коллекции Института вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР (депозит ГКВ № 640). Штамм вируса клещевого энцефалита № 132 характеризуется следующими признаками. Штамм высокопатогенен для беспородных взрослых и но ворожденных белых мышей. При заражении вызывает типичную картину экспериментального энцефалита с инкубационным периодом при внутримозговом заражении 4-5 дней (max титр в log LD 50/мл - 9,72-8,82), при подкожном и внутрибрюшном - 5-6 дне (max титр в log LD 50/мл 8,1-7,8 и 8,3-8,0 соответствен но ) о Индекс инвазивиости 1,6-1,12. Гемагглютинирующая активность штамма при репродукции в мозге Ntaшей 1:2560 - 1:10240 в зонах ph b,U 7,0, Индекс инактивации штамма эфиром - 2,5 (в log LD 50/0,03i индек инактивации дезоксихолатом натрия 1,6, индекс терморезистентности - 2 Штамм 132 хорошо размножается перевиваемой культуре ткани СПЭВ, в зывая четкую деструкцию клеток на 4-5-ые сутки. Пик накопления инфекционной и гемагглютинирующей активности отмечается на 5-ые сутки. Тит вируса культуральной жидкости на 5-ые сутки инкубации при 37°С соетавляет 5,5 (в log LD 50/0,03. Штамм № 132 обладает высокой бляшко образующей активностью, под агаровы покрытием титр по БОЕ на культуре СПЭВ 8,1-10,1 log БОЕ/мл. Титр по ВОЕ коррелирует с показателем интра церебральной активности на мышах. Бляшки появляются на 4-ые сутки, ге терогенные, S-- признак 1,0-2,5 мм. Антиген, полученный из данного штамма, имеет максимальный титр в РГА до 1:10240. Штамм № 132 в реакции биологической нейтрализации нейтрализуется гомологичными сыворо ками и сыворотками к штаммам вируса клещевого энцефалита Софьин, Хабаровский-17, Абсеттаров. Индек сы нейтргшизации с гомологичными сыворотками 3,3-3,0 с сыворотками к штамму Софьин 4,0-3,1, с сывороткой к штамму Хабаровск-17 2,9, с сывороткой к штамму Абсеттаров 2,8-2,7. Антигенные свойства штамма изучены в перекрестной РТГА, РСК и в кинетической РТГА. Установлено, что штаМм № 132 обладает более высокой антигенной активностью по срав.нению со штаммом Софьин, быстрее связывается с антителами и в 2-3 раза превышает по титру коммерческий антиген. в перекрестной РТГА с использованием гипериммунных сывороток выявлено тесное антигенное родство с западными и восточными штаммами вируса клещевого энцефалита и более высокая активность штамма № 132, который выявил антитела в сыворотках в 2-8 раза в более высоких титрах. Кроме того, выявлена хорошая активjHiocTb антигена из штамма № 132 в . В перекрестной РСК исследовали по 6 гиперимунных крысиных сывороток к штаммам № 132 и Софьин. Средняя геометрическая титров антител в сыворотках при иcпoJy зoвaнии штамма № 132 5,6, штамма Софьин 4,3 (средняя геометриче1зкая логарифмов с основанием 2К В РСК с гипёриммунной сывороткой кроликов к Софьин титр при использовании антигена из штамма № 132 1:16 , из штамма Софьин - 1:16. Пример 1. Пассирование вирусов. ВеспорЬдных белых мышей весом 6-7 кг заражают в мозг по 0,03 мл вирусной суспензии штамма № 132. При появлении выраженных параличей на 4-5-ые сутки мышей забивают, извлекают асептично .мозг и готовят 10%-ную суспензию мозговой ткани путем рас- тирания мозга в ступке с добавлением физиологического раствора. Полученные мозговые взвеси центрифугируют при 1000-1500 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную взвесь отсасывают и используют для заражения партии мышей,, инфицированный мозг которых используется для приготовления антигена. I Приготовление антигенов. Из полученных инфицированных мозгов готовят 10%-ную взвесь на боратном буферном растворе с ph 9,0 и экстрагируют 24 ч при +4°С, затем взвесь центрифугируют на холоде при 9000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость обрабатывают протаминсульфатом из расчета 6-9 мг сухого препарата на 10 мл вирусной суспензии. Полученную взвесь помещают в холодильник при на 30 мин и затем центрифугируют 15 мин при 2000 об/мин также на холоде. Полученную Надосадочную жидкость-антиген инактивируют бетапропиолактонЪм 1:1000 в течение 30 мин при ifOMнатной температуре (помешивая взвесь через 5-10 мин). Действие бетапропиолактона (через 30 мин) гасят 14%-ным гипосульфитом натрия (на 10 мл антигена 1,2-мл 14%-ного гипосульфита). Полученные таким образом антигены из мозга мышей методом обратносолевой экстракции,обработанные протаминсульфатом,инактивированные бетапропиолактоном,прошедшие контроль без-вредности на беспородных белых мышах /были использованы В РТГА в сравнительном титровании 4-х групп сывороток. Были исследованы сыворотки доноров из Хабаровска, используе1 «ле для

приготовления иммуноглобулинов, сыворотки людей, привитых очищенной, концентрированной вакциной против клещевого энцефалита, сиворотки больных с диагнозом клещевой энцефалит и ткпоспецифические иммунные сыворотки. В опыте, кроме экспериментальных серий антигенов из штамма № 132, использован диагностикум клещевого энцефалита, штамм Софьин

сер, 59, выпускаемый Томским иве.

Полученные результаты представлены в таблице (средние титры антител при испытании различных диагностикумов.

Штамм вируса клещевого энцефалита 132, ГКВ 640 (коллекция Института вирусологии АМН СССР им. Д.И. Ивановского), используемый для приготовления гемагглютинирующего инактивированного диагностикума. (Л