КОСМИДНЫЙ ВЕКТОР PC LF*993 ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК В КОРИНЕБАКТЕРИЯХ Российский патент 1996 года по МПК C12N15/77 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой космидный вектор pСLF3 для клонирования фрагментов ДНК в коринебактериях. Предлагаемый космидный вектор является челночным плазмидным вектором для бактериальной системы Escherichia coli - коринебактерии и может быть использован для клонирования фрагментов ДНК в промышленно-важных коринебактериях, а также для переноса клонированных фрагментов ДНК между различными штаммами коринебактерий.

Коринебактерии (Corynebacterium glutamicum, Brevibacte- rium flavum, Brevibacterium lactofermentum и др. ) используются в микробиологической промышленности в качестве продуцентов аминокислот и других биологически активных веществ. В последнее время для создания коринебактериальных штаммов-продуцентов аминокислот все чаще используют амплификацию генов биосинтеза аминокислот путем клонирования данных генов в плазмидных векторах (Martin et al. 1987). Перенос клонированных в плазмидном векторе генов из одного штамма коринебактерий в другой осуществляется с помощью трансформации - метода, требующего больших затрат времени, труда и средств.

В литературе описаны космиды плазмиды, содержащие cos-сайт фага и способные к упаковке в капсид фага при участии фага-помощника (Feiss et al. 1982. Flock, 1983; Morino et al. 1985). Перенос космид из одного бактериального штамма в другой осуществляется с помощью метода трансдукции. Имеются космидные векторы для клонирования ДНК (Ish-Gorowitz, Burke, 1981). Единственным известным космидным вектором для коринебактерий является вектор pAJ667, описанный Miwa et al. (1986). Этот вектор выбран нами в качестве прототипа. Космидный вектор paAJ667 имеет размер 7,2 т.п.н. и содержит cos-сайт фага f1A В. lactofermentum. Космидный вектор pAJ667 можно использовать для трансдукции В. lactofermentum и С. glutamicum. Размер генома фага f1А 15,8 т.п.н. Этот факт обуславливает важный недостаток космидного вектора pAJ667 небольшую емкость, которая не может значительно превышать 8,6 т.п.н. (15,8 7,2 8,6).

Нашей целью является создание космидного вектора большой емкости, позволяющего проводить клонирование ДНК в коринебактериях. Цель достигается созданием нового космидного вектора pСLF3. Штамм В. flavum Rif^r pСLF3, содержащий космидный вектор pСLF3, депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В5996.

Предлагаемый новый космидный вектор pСLF3 (фиг. 1) размером 10,5 т.п.н. состоит из следующих элементов:
ЕсоRI-BаmHI-фрагмента генома фага BBL1 B. flavum (Ахвердян и др. 1990) размером 1,1 т.п.н. включающего участок липких концов генома (cos-сайт) этого фага;
плазмиды pUC19 (Janisch-Perron et al. 1985) размером 2,7 т.п.н. несущей ген β--лактамазы, который обеспечивает устойчивость клеток E. coli к ампициллину (Ар), а также участок инициации репликации (ori) в кишечной палочке;
криптической плазмиды pSR1 C. glutamicum (Yoshihama et al. 1985) размером 3,0 т.п.н. содержащей участок инициации репликации (ori) в коринебактериях;
ВаmHI-ВаmHI-фрагмента плазмиды pCG4 С. glutamicum (Katsumata et al. 1984) размером 3,7 т.п.н. содержащего ген устойчивости к стрептомицину (Sm) и спектиномицину (Sp).

Упаковку космидного вектора pСLF3 и его рекомбинантных вариантов проводят после инфекции фагом BBL1 штаммов коринебактерий В. flavum АТСС14067, Brevibacterium sp. 22 и их производных, содержащих эти космиды.

Геном фага BBL1 имеет размер 41 т.п.н. а космида pcLF3 имеет размер 10,5 т.п.н. Таким образом, клонирующая емкость космидного вектора pСLF3 - приблизительно до 30,5 т.п.н. (41 10,5 30,5), что значительно превышает клонирующую емкость прототипа (приблизительно до 8,6 т.п.н.).

Космидный вектор pСLF3 содержит следующие сайты рестрикции: EсoRI, принятый за точку начала отсчета, (0 т.п.н.), Pvull (0,1 т.п.н.), Pvull (2,5 т. п. н. ), EсoRI (4,2 т.п.н.), Pvull (5,3 т.п.н.), EcoRI (7,4 т.п.н.), в том числе доступные для клонирования методом инсерции сайты Sall (2,7 т.п.н.) и Xbal (2,7 т.п.н.), а также доступные для клонирования методом замещения сайты Рstl (2,7 т.п.н.) и Рstl (3,1 т.п.н.).

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами.

Фиг. 1. Физическая и генетическая карты космиды pCLF3. Закрашенный участок карты соответствует ДНК фага BBL1, заштрихованный участок ДНК плазмиды pUC19 Е. coli, участок без окраски и штриховки ДНК плазмиды pSR1 C. glutamicum, тонкий участок ДНК плазмиды pCG4 C. glutamicum.

Фиг. 2. Схема конструирования космидного вектора pCLF3. Закрашенные участки физических карт соответствуют ДНК фага BBL1, заштрихованные участки - ДНК плазмиды рUC19 E. coli, участки без окраски и штриховки ДНК плазмиды pSR1 C. glutamicum, тонкие участки ДНК плазмиды pCG4 C. glutamicum. Молекулярные размеры плазмид и фрагментов ДНК указаны в т.п.н.

Фиг. 3. Физическая карта области липких концов генома фага BBL1. Расстояния между ближайшими сайтами рестрикции указаны в т.п.н.

Фиг. 4. Физическая и генетическая карты плазмиды pYY1 (плазмида pYY1 является делеционным вариантом фазмиды рАSD3). Заштрихованный участок карты соответствует ДНК плазмиды рUC19 Е. сoli, которая входит в состав фазмиды рАSD3, тонкий участок ДНК фага λ и С. glutamicum.

Пример 1. Способ конструирования космидного вектора рСLF3.

Выращивают фаг BBL1 коринебактерии B. flavum (Ахвердян и др. 1990) и выделяют из него ДНК. Рестрикционный анализ показал, что размер генома фага BBL1 составляет 41 т.п.н. BamНI-фрагменты с размерами 0,8 и 1,7 т.п.н. содержат липкие концы фага, а BamHI-фрагмент размером 2,5 т.п.н. содержит целую cos-последовательность фага.

Проводят лигирование и расщепление рестриктазой BamHI 100 мкг ДНК фага BBL1 B. flavum. После препаративного электрофореза в легкоплавкой агарозе выделяют BamHI-фрагмент 2,5 т.п.н. который содержит cos-последовательность фага BBL1. Клонируют данный фрагмент в составе вектора рUC19 в штамме Е. сoli JM109 (Janisch-Perron et al. 1985). Полученная рекомбинантная плазмида получила название pCLF1 (фиг. 2). Факт клонирования фрагмента ДНК фага подтверждают гибридизацией ДНК плазмиды pCLF1 с меченной [³²P] ДНК фага BBL1. Определяют рестрикционную карту клонированного BamНI-фрагмента фага (фиг. 3). ДНК плазмиды pСLF1 последовательно обрабатывают рестриктазами EcoRI и ВаmHI, а затем инкубируют с лигазой. После трансформации с помощью полученной смеси штамма Е. сoli JM109 отбирают колонии, содержащие плазмиду pUC19 со вставкой ВаmHI-ЕсоRI-фрагмента 1,1 т.п.н. с cos-последовательностью BBL1 (pCLF2).

Проводят расщепление рестриктазой BamHI 100 мкг ДНК плазмиды pCG4 C. glutamicum. Плазмида рCG4 несет детерминант устойчивости к Sp и Sm) (Katsumata et al. 1984). После препаративного электрофореза в легкоплавкой агарозе выделяют BamHI-фрагмент 3,7 т.п.н. плазмиды рСG4. ДНК плазмиды pSR1 C. glutamicum гидролизуют в уникальном сайте с помощью рестриктазы BglII. Выделенный BamHI-фрагмент плазмиды pCG4 смешивают с линеаризованной с помощью рестриктазы BglII плазмидой pSR1, проводят лигирование и трансформируют протопласты C. glutamicum с помощью полученной лигированной смеси. Анализируют плазмидную ДНК из отобранных по устойчивости к Sp и Sm трансформантов. Один из полученных нами трансформантов содержал гибридную плазмиду, которую обозначили pFD9 (фиг. 2).

Плазмиду pCLF2 разрезают в уникальном сайте BamHI, коринебактериальную плазмиду pFD9 с детерминантом устойчивости к Sp и Sm разрезают в уникальном сайте BglII, полученные препараты ДНК смешивают и обрабатывают лигазой. Для трансформации лигированной смесью используют штамм Е. coli JM109, отбор трансформантов ведут по устойчивости к Sp. Из трансформантов выделяют плазмидную ДНК. Одну из изолированных бирепликонных плазмид мы обозначили pСLF3 (фиг. 2, фиг. 1). С помощью плазмиды pСLF3 трансформируют штамм Brevibacterium sp. Е531, который является производным штамма Brevibacterium sp. 22.

Далее исследуют способность фага BBL1 осуществлять трансдукцию B. flavum с помощью плазмиды pCLF3, несущей cos-область этого фага. Фаг BBL1 выращивают на штамме Brevibacterium Bр. Е531, содержащем плазмиду pСLF3. Определяют способность полученного препарата фага осуществлять перенос плазмидного маркера Sp^r в штамм B. flavum Rif^r. Контрселекцию против клеток донорного штамма, загрязняющих препарат фага, проводят при помощи рифампицина. Эффективность трансдукции составляет 1,5х10^-4 трансдуктантов на 1 бляшкообразующую единицу. У полученных трансдуктантов проверяют наличие второго плазмидного маркера Sm^r, а также прототрофности маркера реципиентного штамма. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК из трансдуктантов свидетельствует об инвариантности структуры плазмиды до и после трансдукции. Полученные данные свидетельствуют о переносе плазмиды рСLF3 в штамм B. flavum Rif^r путем трансдукции этого штамма фагом BBL1. Наличие такого переноса говорит о функциональной активности клонированного в составе плазмиды pCLF3 cos-сайта фага ВВL1. Плазмида pСLF3 является, таким образом, космидой.

Пример 2. Клонирование в космидном векторе pCLF3 генов lуsСa и lysCb С. glutamicum.

Гены lуsСa и lуsСb С. glutamicum детерминируют фермент аспартаткиназу (Kalinowsky et аl.1990).

Исходным материалом служит фазмида рАSD3 Е. сoli (Передельчук и др. в печати) с генами lysСa и lysСb С. glutamicum. Выделяют ДНК рАSD3 и с ее помощью трансформируют Е. сoli LE392. Отбирают клоны, содержащие возникшее in vivo делеционное производное фазмиды рАSD3 плазмиду pYY1 (фиг. 4). Далее плазмиду pYY1 последовательно обрабатывают рестриктазой BamНI и лигазой, с помощью полученного препарата ДНК трансформируют Е. coli JM109 и в полученных трансформантах обнаруживают делеционное производное плазмиды рYY1, обозначенное нами как pYY2 (8,0 т.п.н.). В плазмиде pYY2 отсутствует BamНI-фрагмент плазмиды pYY1 размером 1,7 т. п. н. Плазмиду pYY2 обрабатывают рестриктазой Sall и смешивают с космидным вектором pCLF3, обработанным той же рестриктазой. Используют 6-кратный избыток ДНК pYY2. Полученную смесь инкубируют с лигазой и используют для трансформации штамма Е. coli JM109. Селекцию трансформантов ведут по маркеру pСLF3 устойчивости к Sр. Среди полученных трансформантов около 25% составляют клоны с искомой вставкой Sall-SalI-фрагмента 4,1 т.п.н. в космидный вектор pСLF3 (SalI-SalI-фрагмент плазмиды pYY2 размером 4,1 т.п.н. содержит генетический материал Sall-BamHI-фрагмента 4,1 т. п.н. плазмиды pYY1). Одну из рекомбинантных плазмид мы обозначили pСLF5. Вводят плазмиду pCLF5 в штаммы Brevibacterium sp. Е531 (является производным штамма Brevibacterium sp. 22) и В. flavum Rif^r. Демонстрируют, что плазмида pCLF5 сообщает штамму В. flavum Rif^r:1) способность продуцировать лизин в ходе ферментации (около 5 г/л); 2) увеличенную в 12 раз активность аспартаткиназы. Указанные свойства плазмиды pСLF5 доказывают, что: 1) в составе этой плазмиды клонированы гены lуsСab С. glutamicum; 2) гены lysCab С. glutamicum выражаются в В. flavum.

Далее демонстрируют способность фага BBL1 переносить космиду pСLF5 с генами lysСab из штаммов B. flavum Rif^r и Brevibacterium sp. Е531 в штаммы В. flavum Rif^r (3х10^-4 трансдуктантов на 1 бляшкообразующую единицу) и Brevibacterium sp. Е531 (2х10^-3 трансдуктантов на 1 бляшкообразующую единицу). Таким образом, способность космиды pСLF3 к переносу фагом BBL1 сохраняется после клонирования в данном векторе дополнительного генетического материала. ЫЫЫ2

Использование: биотехнология, в частности, генетическая инженерия. Сущность изобретения: представляет собой космидный вектор рСLF3 для клонирования фрагментов ДНК в коринебактериях. Этот космидный вектор является челночным плазмидным вектором для бактериальной системы Escherichia coli - коринебактерии и может быть использован для клонирования фрагментов ДНК в промышленно-важных коринебактериях, а также для переноса клонированных фрагментов ДНК между различными штаммами коринебактерий с помощью метода трансдукции фагом. Молекулярный размер рCLF3 - 10,5 т.п.н., емкость - около 30,5 т. п. н. В изобретении описывается схема конструирования космидного вектора рCLF3. 4 ил.

Космидный вектор pCLF3 для клонирования фрагментов ДНК в коринебактериях, размером 10,5 т.п.н. содержащий EcoRI-BamHI фрагмент генома фага BBLI. В.flavum размером 1,1 т.п.н. включающий участок липких концов генома cos-сайта этого фага, плазмиду pU C19 размером 2,7 т.п.н. несущую ген β-лактамазы с участком инициации репликации ori в кишечной палочке, криптическую плазмиду pSRIC. glutamicum размером 3,0 т.п.н. с участком инициации репликации ori в коринебактериях, BamHI-BamHI фрагмент плазмиды pCG 4 с glutamicum размером 3,7 т.п.н. с генами, обеспечивающими устойчивость к стрептомицину и спектиномицину, генетические маркеры: ANp

ген устойчивости к ампициллину клеток Escherichia coli; Srm ген устойчивости к стрептомицину клеток коринебактерий и клеток Escherichia coli; Srp ген устойчивости к спектиномицину клеток коринебактерий и клеток Escherichia coli: сайты рестрикции: EcoRI, принятый за точку начала отсчета (0 т.п.н.), PvuII (0,1 т.п.н.), PvuII (2,5 т.п.н.), PstI (2,7 т.п.н.), PstI ( 3,1 т.п.н.), EcoRI (4,2 т.п.н.), PvuII (5,3 т.п.н. ), EcoRI (7,4 т.п.н.), в том числе уникальные сайты SalI (2,7 т.п.н.) и XbaI (2,7 т.п.н.), емкость до 30,5 т.п.н. спектр хозяев: коринебактерии и Escherichia coli.