СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N9/08 C12N9/08 C12R1/645 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения пероксидазы, фермента, активно используемого в анализе.

Пероксидаза является хорошо изученным ферментом, который получают из различных источников. Широкое использование получили пероксидазы из растений, особенно хрена (1), все больший интерес вызывают пероксидазы, продуцируемы микроорганизмами: бактериями (2), водорослями (3), дрожжами (4). Наиболее активные пероксидазообразующие штаммы отмечены среди грибов.

В качестве прототипа можно рассматривать способ получения пероксидазы, предусматривающий глубинное культивирование грибов вида Phellinus igniarius 71-31 (5). Гриб выращивают на жидкой питательной среде, содержащей 20 г/л глюкозы, 1 г/л пептона, 200 мл/л сусла, рН до стерилизации 6,0-6,2. Культивирование проводят в стационарных условиях при 24^o. Активность пероксидазы на 14-е сутки культивирования составляет 7,9 мкмоль/мин на 1 мл культуральной жидкости.

Задачей изобретения является разработка способа получения пероксидазы с помощью нового штамма Phellinus igniarius ВКПМ F-686. Культура получена из плодовых тел дереворазрушающих грибов, собранных с древесины пораженных деревьев в Московской области.

Штамм имеет следующую характеристику.

Культурально-морфологические признаки.

Вегетативное тело (таллом) представлено мицелием. Субстратный мицелий хорошо развит, гифы гриба рыжеватые или коричнево-бурые с толстыми стенками 2,5-4,5 мкм, пряжки появляются на двадцатые сутки, пряжки единичные, мицелий септированный. На среде сусловый агар на пятые сутки колонии среднерастущие достигают диаметра 20 мм при 24-26^o, край колонии ровный, пушистый, белый. На десятые сутки диаметр колонии 52 мм, край белый, менее пушистый, рост более плотный, чем на пятые сутки, в середине колонии намечается маленький валик, появляются круги разного цвета от сомона л2 до кремового Б6. На тридцатые сутки диаметр колонии 85 мм, край темно-коричневый, кожистый, плотный, валик в средине колонии четко обозначен, цвет бледно-песочный К3, сомон л2, кремовый Б6.

Тип размножения вегетативный (мицелием), половое (базидиоспорами), покоящиеся структуры единичные хламидиоспоры.

Биохимические признаки.

Отношение к углеводам. Усваивает сахарозу, глюкозу, арабинозу, фруктозу, мальтозу, глицерин, ксилозу. Плохо целлюлозу.

Отношение к источнику азота. Усваивает пептон, дрожжевой экстракт, аминокислоты, плохо цистеин.

Кардинальные температуры роста: максимальная 30^o, оптимальная - 24-25^o, минимальная 4^o.

Скорость роста на агаризованной среде 4,2-4,4 мм в сутки.

Для получения пероксидазы штамм выращивают методом твердофазной ферментации на частицах виноградной лозы или подсолнечной шелухи, увлажненных водой, содержащей пептон. Грибы выращивают 10-12 суток при 24-25^o. Пероксидазу экстрагируют из субстрата, проросшего мицелием гриба. Пероксидазная активность экстракта составляет 11-13 мкмоль/мин*мл.

Пероксидаза, полученная методом твердофазной ферментации гриба Phellinus igniarius ВКПМ F-686, имеет молекулярную массу, определенную методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS, 36 кДа. Изоэлектрическая точка (рI) 3,5, RZ-2,5, рН-оптимум 5,0-7,0, рН-стабильность при 37^o, 1 ч 5,5-6,5.

Изобретение поясняется следующими примерами:
Пример 1. Сыпучую питательную среду, состоящую из частиц виноградной лозы (1-2 см), увлажненных до 80% водой, содержащей 1% пептона, рН 6, вносят в кюветы по 150 г слоем 4 см, автоклавируют при 1 атм 30 мин. Подготовленную таким образом среду инокулируют культурой гриба Phellinus igniarius ВКПМ F-686, которую вносят в среду в количестве 3-4% от веса субстрата. Из субстрата, проросшего мицелием гриба, экстрагируют пероксидазу, добавляя 0,01 М трис-НCl буфер рН 6,0 из расчета 150 мл буферного раствора на 100 г субстрата. Экстракцию ведут в течение часа, после чего экстракто отделяют от субстрата, проросшего мицелием гриба, и определяют в нем активность пероксидазы, которая составляет 12,3 мкмоль/мин*мл.

Активность пероксидазы определяют следующим образом. В реакционную смесь, содержащую 20 мкл экстракта, 20 мл Na-ацетатного буфера (рН 5,0), в котором растворено 0,2 мг/мл диаммониевой соли 2,2'-азино-ди-3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты (АВТS), используемой в качестве субстрата, добавляют 0,1 мл 0,03% раствора перекиси водорода. Реакционная смесь приобретает ярко-голубой или темно-синий цвет в зависимости от концентрации в растворе пероксидазы. Оценку содержания пероксидазы осуществляют на спектрофотометре при длине волны 405 нм, используя коэффициент экстинкции окисленной формы АВТS, равный 36,8 мМ^-1см^-1.

Пример 2. Способ осуществляют согласно примеру 1, но в качестве твердой фазы используют подсолнечную шелуху. Активность пероксидазы 12,9 мкмоль/мин*мл.

Исследование: биотехнология и может быть использовано в анализе. Сущность изобретения: способ получения пероксидазы предусматривает твердофазное культивирование гриба Phellinus igniarius ВКПМ F-686. В качестве твердой фазы используют частицы виноградной лозы или подсолнечную шелуху, увлажненные до содержания влаги 80%, водой, содержащей 1% пептона. Активность пероксидазы - 11-13 мкмоль/мин х мл. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения пероксидазы, предусматривающий культивирование гриба вида Phellinus igniarius, отличающийся тем, что культивирование осуществляют на твердой фазе, а из гриба вида Phellinus igniarius используют штамм гриба Phellinus igniarius ВКПМ F-686. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве твердой фазы используют измельченные частицы виноградной лозы или подсолнечную шелуху, увлажненные водой, содержащей пептон.