ГИДРОХЛОРИДЫ СЕРОСОДЕРЖАЩИХ 2-АМИНОИМИДАЗОЛОВ ИЛИ 2-АМИНОТИАЗОЛОВ, ОБЛАДАЮЩИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ И ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ И ПРОЯВЛЯЮЩИЕ ИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ В ОТНОШЕНИИ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 1997 года по МПК C07D233/88 C07D277/40 C07D403/12 C07D417/12 

Описание патента на изобретение RU2076864C1

Изобретение относится к органической химии, а точнее к новым соединениям гидрохлоридам 2-аминоимидазолов и 2-аминотиазолов общей формулы (1),

содержащим арильный заместитель в положении 4 и дисульфидный мостик в положении 5, где Х-алкиламиногруппа, например, метиламино, а R1-R2-водород (соединение 1); Х-метиламиногруппа, а R1-алкил, например, метиламино, а R1-R2-водород (соединение I); Х-метиламиногруппа, а R1-алкил, например, метил и R2-водород (соединение II); Х-метиламиногруппа, а R1-алкоксигруппа, например, метокси и R2-водород (соединение III); Х-метиламиногруппа, а R1-этоксигруппа и R2-водород (соединение IV); Х-метиламиногруппа, а R1-галоген, например, хлор и R2-водород (соединение V); Х-метиламиногруппа, а R1-R2-алкоксигруппа, например, метокси (соединение VI); X-этиламиногруппа, а R1-алкоксигруппа, напpимер, метокси и R2-водород (соединение VII); Х-сера, а R1-алкоксигруппа, например, метокси и R2-водород (соединение VIII); Х-сера, а R1-R2-алкоксигруппа, например, метокси (соединение IX); Х-сера, а R1-галоген, например, фтор и R2-водород (соединение Х); которые обладают цитотоксической и противоопухолевой активностью и проявляют ингибирующее действие в отношении некоторых ферментов.

Среди большого числа описанных в литературе имидазолов не встречаются соединения, содержащие в молекуле одновременно аминогруппу в положении 2, арильный заместитель в положении 4 и сернистую функцию в положении 5. Из известных 2-аминоимидазолов наиболее близкими по строению к заявляемым являются соединения (2) [1] (3) [2] (4) [3] (5) [4] (6) (10) [5] (11) [6,7] (12) [3,6,7] (13) (15) [8] (16) [9 12] (17) [13] и (8) [13] Как видно, лишь соединения (17) и (18) содержат заместитель в положении 1, то есть по строению они являются наиболее близкими к соединениям типа (1). Однако в положении 4 они содержат заместитель иной природы, чем в соединениях типа (1), и не содержат сернистой функции в положении 5.


Все соединения (2) (18) проявляют в той или иной мере биологическую активность. Большинство из них проявляет выраженную антимикробную активность, значения которой достигают наибольшей величины у таких соединений, как ороидин (4), О-дезалкилпуррелин (5), сцептрин (12), наомин (17) и изонаомин (18).



Сообщалось о проявлении соединениями (12а), (12б), (12в), (13), (14) и (15) противовирусной активности в отношении вируса Herpes simplex, тип I и вируса Vesicular stomatitis [6]
Некоторые из обсуждаемых 2-аминоимидазолов являются антагонистами ряда рецепторов. Так, гименидин (3) антагонист серотонергических рецепторов, а клатридин (2) обладает мощным блокирующим действием в отношении холинергических рецепторов на изолированной скелетной мышце лягушки в концентрациях 10-7 10-3 M.

Отмечалась активность 2-аминоимидазолов в отношении ряда ферментов. Так, пуреалин (6) является активатором миозиновой K+, EDTA-АТФазы [5] а оксисцептрин (11б), агелиферин (13), бромагелиферин (14) и дибромагелиферин (15) оказывают мощное активирующее действие на актомиозиновую АТФазу миофибрил из скелетной мышцы кролика [7, 8] Соединения (6) (9) проявляют выраженное ингибирующее действие в отношении Na+, K+-АТФазы, а (10) слабо ингибирует ее (22% ингибирования при концентрации 10-4 М).

Имеется весьма мало сведений о цитотоксичности и противоопухолевом действии 2-аминоимидазолов. Для пуреалидина (10) отмечалась значительная цитотоксичность в отношении клеток L1210 мышиной лейкемии in vitro (ИД50 1,1 мкг/мл [5] ), а для клатридина (2) в отношении клеток СНО-К1 (ИД50 1,33 мкг/мл [1]).


Среди известных 2-аминоимидазолов лишь гироллин (16) проявляет противоопухолевую активность в отношении клеток лейкемии P388. При внутрибрюшинном введении мышами ИД50 составляла 1,0 мг/кг [9] В литературе более не сообщалось о проявлении противоопухолевого действия какими-либо 2-аминоимидазолами.

Известны также замещенные в положении 1 имидазолы, содержащие в молекуле сернистую функцию, но не в положении 5, как в заявляемых соединениях типа (1), а в положении 4.


К ним относятся такие производные 4-меркаптогистидина, как выделенные из морских беспозвоночных овотиолы (19) (21) [14 18] аденохромин А (22) [19, 20] и имбрикатин (23) [21] Предполагается, что овотиолы могут действовать в качестве биологических антиоксидантов, являясь на ранних этапах развития эмбрионов морских беспозвоночных ловушкой для интермедиатов, имеющих активный кислород [22 24]

Как видно, соединения (19) (23) существенно отличаются по своей структуре от соединений типа (1): во-первых, они не имеют аминофункции в положении 2, во-вторых, сернистая функция находится в положении 4, а не 5, и имеет иной характер и, в-третьих, заместитель в гетероциклическом ядре находится в положении 5, а не 4, и является алкилом, а не арилом.

Окислительная деструкция имбрикатина (23) дает овотиол А (19), дальнейшее окисление которого иодом в слабом растворе соляной кислоты приводит к дисульфиду (24), имеющему, как и все упомянутые выше соединения, значительные структурные отличия от заявляемых соединений типа (1). О биологической активности (24) не сообщалось.

Сопоставление структур соединений типа (1) и (2) (24) показывает, что соединения (1) являются новым, ранее не известным структурным типом тетразамещенных имидазолов, не имеющих аналогов среди описанных имидазолов как природного, так и синтетического происхождения.

В связи с этим среди известных имидазолов невозможно выбрать структурный прототип для соединений (1). Среди 2-аминоимидазолов наиболее близки к (1) по строению соединения (17) и (18), а среди серосодержащих имидазолов - соединение (24), но все они имеют, в тоже время, весьма существенные структурные отличия от соединений типа (1).

Если же подбирать прототипы по биологическому действию, то ни одно из упомянутых выше соединений (2) (24) не проявляет по литературным данным такого широкого спектра биологической активности, как соединения типа (1), хотя соединения (10) и (16) и проявляют цитотоксическое и противоопухолевое действие, наиболее присущее заявляемым соединениям.

Среди множества описанных в литературе тиазолов известен лишь один пример соединения, содержащего в молекуле одновременно аминогруппу в положении 2, арильный заместитель в положении 4 и сернистую функцию в положении 5, это соединение (25) [25]

Окислением соединения (25) можно было бы получить дисульфид, являющийся близким аналогом соединений (VII)-(X). Эта конверсия, однако, в литературе не описана.

Из других близких к заявляемым соединений описаны соединения (26) [25, 26] и (27) [26] Как видно, характер радикала в положении 4 соединения (26) иной, чем у заявляемых, а соединение (27) совсем не имеет заместителя в положении 4.

Среди известных соединений этого ряда описаны даже тиазолы, содержащие дисульфидный мостик в положении 5 (соединения (28) и (29)) [27] но природа заместителей в положениях 2 и 4 этих соединений, иная чем в заявляемых. Следует, однако, отметить, что убедительных доказательств строения соединений (28) и (29) авторы не приводят.

О биологической активности соединений (25) (29) никаких сведений нет. В литературе нет также сообщений о проявлении 2-аминотиазолами цитотоксического и противоопухолевого действия. Лишь для производных 2-аминотиазолов по NH2-группе обнаружено ростингибирующее действие в отношении клеток лейкемии L1210. Так, метил 4-(изотиоцианометил)тиазол-2-карбамат (30) ингибирует рост клеток лейкемии L1210 в концентрации ИД50 3,2 мкг/мл [28] Первичным механизмом действия этого соединения является митотическое блокирование. Помимо этого, соединение (30) проявило значительную in vivo антифилярную активность в отношении взрослых червей Acanthocheilonema viteae.

Некоторые 2-N-замещенные 2-аминотиазолы, например, соединения типа (31) и (32), проявляют противовоспалительную и диуретическую активность, а также оказывают влияние на центральную нервную систему [29]
Другие 2-N-замещенные 2-аминотиазолы типа (33) проявляют инсектицидную активность в отношении почечного табачного червя Heliothis virescens [30]

Простейший из 4-фенилзамещенных 2-аминотиазолов соединение (34) - обладает анестезирующим действием в отношении рыб [31]

Однако наиболее часто 2-аминотиазолы и их производные используются как антимикробные агенты, поскольку многие из них проявляют высокую антигрибковую и антибактериальную активность. Так, например, соединения типа (35) проявляют высокую фунгистатическую активность в отношении Candida albicans, Aspergillus fumigatus и Epidermophyton floccosum [32]

2-Аминотиазольный фрагмент входит в состав структуры эффективных современных антибиотиков цефалоспоринового ряда, например, используемых в клинике цефтизоксима (36) [33] цефдимира (37) [34] и других природных и синтетических цефалоспоринов [35 38] Все они обладают широким спектром антибактериальной активности и весьма эффективны в отношении широко распространенных аэробных грамположительных бактерий (стрептококки и метициллин чувствительные стафилококки) и грамотрицательных бактерий (членов семейства энтеробактерий, гемофилов, менингококков, гоноккоков). Большинство из них проявляет стабильность к плазмидным и хромосомным бета-лактамазам.

Сопоставление структур заявляемых 2-аминотиазолов (соединения (VIII)-(X)) со структурами вышеприведенных 2-аминотиазолов показывает, что в отличие от ситуации с 2-аминоимидазолами в данном случае соединение (25) может служить близким структурным прототипом для соединений (VIII)-(X), хотя характер его заместителя в положении 5 (тиольная группа) иной, чем в заявляемых соединениях (дисульфидная группа). Это структурное отличие является все-таки весьма существенным. В тоже время сведений о биологической активности соединения (25) в литературе не имеется. Более того, в литературе нет сообщений о проявлении 2-аминотиазолами цитотоксического и противоопухолевого действия, что характерно для заявляемых соединений. Таким образом, если структурный прототип для заявляемых соединений (VIII)-(X) может быть подобран (с известными оговорками), то прототипа по физиологическому действию обнаружить не удалось.

Заявляемые серосодержащие 2-аминоимидазолы и 2-аминотиазолы являются новыми соединениями и в литературе не описаны.

В основу изобретения положена задача создания новых веществ, обладающих цитотоксической и противоопухолевой активностью, проявляющих ингибирующее действие в отношении некоторых ферментов и действующих в низких дозах, которые могут послужить основой для создания новых лекарственных препаратов, расширяющих арсенал средств воздействия на возбудителей заболеваний человека и животных.

Задача решена тем, что заявляются новые соединения гидрохлориды серосодержащих 2-аминоимидазолов и 2-аминотиазолов общей формулы (1),

где Х-алкиламиногруппа, например, метиламино, а R1-R2-водород (соединение I); Х-метиламиногруппа, а R1-алкил, например, метил и R2-водород (соединение II); Х-метиламиногруппа, а R1-алкоксигруппа, например, метокси и R2-водород (соединение III); Х-метиламиногруппа, а R1-этоксигруппа и R2-водород (соединение IV); Х-метиламиногруппа, а R1-галоген, например, хлор и R2-водород (соединение V); Х-метиламиногрупп, а R1-R2-алкоксигруппа, например, метокси (соединение VI); Х-этиламиногруппа, а R1-алкоксигруппа, например, метокси и R2-водород (соединение VII); Х-сера, а R1-алкоксигруппа, например, метокси и R2-водород (соединение VIII); Х-сера, а R1-R2-алкоксигруппа, например, метокси (соединение IX); Х-сера, а R1-галоген, например, фтор и R2-водород (соединение Х), в качестве препаратов, расширяющих арсенал средств воздействия на возбудителей заболеваний человека и животных.

Заявляемые серосодержащие 2-аминоимидазолы и 2-аминотиазолы проявляют цитотоксическое действие в отношении широкого набора клеточных линий различных видов опухолей (исследовано 75 клеточных линий 10-ти видов опухолей), противоопухолевое действие в отношении клеток аденокарциномы Эрлиха, лейкозных клеток P338 и L1210 и ингибирующее действие в отношении K+, Na+-АТФазы из мозга крыс и обратной транскриптазы из саркомы Рауса и вируса птичьей миелобластомы.

Цель достигается либо выделением соединений типа (1), включая и соединение III).

Следует особо подчеркнуть, что изучение строения и физиологической активности соединения III (ему дано название поликарпин), выделенного нами впервые из тропической асцидии Polycarpa aurata, дало толчок развитию исследований по синтезу этого соединения, и как следствие, по синтезу его имидазольных аналогов, I, II, IV-VII, а также тиазольных аналогов VIII-X. Изучение физиологической активности всех этих соединений и составило, в итоге, предмет настоящей заявки на изобретение. Других соединений типа (1) в природных источниках нами не обнаружено.

Лучший вариант осуществления изобретения
Заявляемые соединения серосодержащие 2-аминоимидазолы и 2-аминотиазолы представляют собой кристаллические или аморфные вещества, окраска которых меняется от желтого до оранжевого цвета. Все они устойчивы в обычных условиях хранения. Заявляемые соединения хорошо растворимы в воде, умеренно в этаноле и диметилсульфоксиде.

Строение и состав заявляемых соединений общей формулы (1) подтверждены данными ПМР- и масс-спектров, а также результатами элементного анализа. Приведенные ниже примеры иллюстрируют получение соединений типа (1).

Пример 1. Выделение соединения III из природного источника.

Лиофильно высушенную асцидию Polycarpa aurata (100 г), собранную у берегов Австралии, экстрагировали в течение недели 800 мл этилового спирта. Экстракт упаривали досуха и остаток (1,5 г) хроматографировали последовательно на колонках с полихромом-1 (система растворителей вода:этанол 2:1), силикагелем (100 150 меш.) (система растворителей хлороформ:этанол 6:1) и сефадексом LH-20 (система растворителей хлороформ:этанол 4:1), собирая окрашенную фракцию. Последнюю доочищали методом препаративной ВЭЖХ на колонке с Phenyl-Si100-Polyol в системе растворителей ацетонитрил:вода 4:1. Получена окрашенная фракция. Удаление растворителей и двойная кристаллизация остатка из смеси хлороформ:этанол 1:4 дали 13 мг (0,013%) дигидрохлорида бис[2-амино-1-метил-4-(4-метоксифенил)-5-имидазолил] дисульфида III, желто-оранжевый порошок, т. пл. 209 211oC (с разл. ). УФ-спектр (C2H5OH, λmax, ε): 210 (17900), 263 (23500), 362 (5000) нм. ИК-спектр (CHCl3, νmax): 1558, 1611, 1650, 3100 3400 см-1. ПМР-спектр (CD3OD, δ, м.д. ТМС): 3,25 (c, 6H, 2xNMe), 3,93 (c, 6H, 2xOMe), 7,07 (м, 4Наром), 7,49 (м, 4Наром). Спектр ЯМР13C (CD3OD): 30,0 (к), 56,7 (к), 112,0 (с), 115,0 (д), 119,0 (с), 129,6 (д), 139,2 (с), 149,1 (с), 163,3 (с). Масс-спектр (m/z, отн. инт. в 70 эВ): 468 (M+, 0,1), 235 (13), 234 (20), 233 (100), 232 (4), 218 (12), 204 (15), 203 (55), 202 (21), 194 (2), 193 (6), 192 (28), 188 (21), 152 (29). Строение поликарпина III подтверждено также данными рентгеноструктурного анализа.

Пример 2. Синтез поликарпина III.

Соединение III было синтезировано из товарного п-метоксиацетофенона (38) в соответствии со схемой 1:
Бромирование п-метоксиацетофенона (38). Бромирование (38) осуществляли действием CuBr2 в смеси уксусной кислоты с хлороформом в соответствии с методикой [39] что дало фенацилбромид (39) в виде игл с т.пл. 65 66oC (выход 62% ). Спектр ПМР (d, м.д. CDCl3): 3,90 (c, 3H, OMe), 4,41 (c, 2H, CH2Br), 6,98 (м, 2Наром), 7,98 (м, 2Наром).


Схема 1
Превращение фенацилбромида (39) в гидрохлорид аминокетона (40). К раствору 343 мг (1,5 ммоль) (39) в 2 мл абс. C2H5OH добавляли 35 мл раствора избытка метиламина в абс. C2H5OH. Смесь выдерживали непродолжительное время при 45 60oC, выливали в воду, экстрагировали эфиром, экстракт высушивали, упаривали до объема ≈ 25 мл и барботировали через него сухой HCl. Эфир удаляли, к остатку добавляли бензол и растворитель упаривали. К остатку добавляли небольшое количество ацетона, выделившийся осадок отфильтровывали, промывали ацетоном и высушивали. Получено 250 мг (83%) соли аминокетона (40) в виде бесцветных мелких кристаллов с т.пл. 165 168oC. Спектр ПМР (δ, м.д. CDCl3); 2,82 (c, 3H, NHMe), 3,91 (c, 3H, OMe), 4,67 (c, 2H, CH2), 7,09 (м, 2Наром), 8,01 (м, 2Наром).

Конверсия гидрохлорида аминокетона (40) в 2-амино-1-метил-4- (4-метоксифенил)имидазол (41). К охлажденному на ледяной бане раствору 526 мг (2,84 ммоль) гидробромида S-этилтиомочевины в 5 мл H2O при перемешивании добавили охлажденный раствор 236 мг (5,89 ммоль) NaOH в 15 мл H2O. К полученной смеси по каплям добавили раствор 615 мг (2,84 ммоль) соединения (40). Смесь оставили на утки при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровали, промыли водой и высушили в вакуум-эксикаторе. К полученному продукту добавили небольшое количество хлороформа, кипятили в течение 3 5 минут и отфильтровали нерастворившееся вещество. Получено 433 мг (75%) имидазола (41), т.пл. 208 211oC (из диоксана). Спектр ПМР (d, м.д. CD3OD): 3,42 (c, 3H, NMe), 3,78 (c, 3H, OMe), 6,78 (c, 1H, H-5), 6,86 (м, 2Наром), 7,50 (м, 2Наром). Масс-спектр (m/z, отн. инт. в 70 эВ): 204 (M++1, 20), 203 (M+, 33), 188 (100), 160 (11), 147 (12), 146 (13), 119 (11), 118 (12), 77 (14).

Превращение 2-аминоимидазола (41) в бис[2-амино-1-метил-4- (4-метоксифенил)-5-имидазолил]дисульфид дигидрохлорид III (поликарпин). К раствору 102 мг (0,5 ммоль) соединения (41) в 4 мл лед. НОАс прибавляли по каплям при перемешивании 102 мг (0,75 ммоль) S2Cl2. Смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 5 ч, разбавляли ее 25 мл глима, выпавший осадок отделяли, промывали глимом и высушивали в вакууме. Получено 97 мг (72%) поликарпина III в виде желто-оранжевого порошка с т.пл. 209 211oC (с разл.). По своим физико-химическим характеристикам полученное соединение оказалось полностью идентичным природному поликарпину III, полученному в примере 1.

Пример 3. Получение дигидрохлорида бис[2-амино-1-метил-4- фенил-5-имидазолил]дисульфида 1.

Соединение I было получено из товарного ацетофенона в соответствии со схемой, изложенной в примере 2. Желто-оранжевый порошок с т.пл. 239 - 242oC (с разл.). Спектр ПМР (CD3OD): 3,21 (c, 6H, 2xMe), 7,39 - 7,58 (м, 10Наром.).

Пример 4. Получение дигидрохлорида бис[2-амино-1-метил-4-(4- метилфенил)-5-имидазолил]дисульфида II.

Соединение II было получено из товарного п-метилацетофенона в соответствии со схемой, изложенной в примере 2. Желто-оранжевый порошок с т.пл. 209 212oC (с разл. ). Спектр ПМР (CD3OD): 2,47 (c, 6H, 2xMe), 3,24 (c, 6H, 2xNMe), 7,34 (м, 4Наром.), 7,42 (м, 4Наром.).

Пример 5. Получение дигидрохлорида бис[2-амино-1-метил-4- (4-этоксифенил)-5-имидазолил]дисульфида IV.

Соединение IV было получено из товарного п-этоксиацетофенона в соответствии со схемой, изложенной в примере 2. Желто-оранжевый порошок с т.пл. 202 205oC (с разл.). Спектр ПМР (CD3OD): 1,45 (т, J 7,1 Гц, 6Н, 2xCH2CH3), 3,26 (с, 6Н, 2xNMe), 4,16 (к, J 7,1 Гц, 4Н, 2xCH2CH3), 7,04 ( м, 4Наром.), 7,48 (м, 4Наром.).

Пример 6. Получение дигидрохлорида бис[2-амино-1-метил-4-(4- хлорофенил)-5-имидазолил]дисульфида V.

Соединение V было получено из товарного п-хлорацетофенона в соответствии со схемой, изложенной в примере 2. Желто-оранжевый порошок с т.пл. 222 - 225oC (с разл.). Спектр ПМР (CD3OD): 3,31 (c, 6H, 2xNMe), 7,51 (м, 4Наром.), 7,56 (м, 4Наром.).

Пример 7. Получение дигидрохлорида бис[2-амино-1-метил-4- (3,4-диметоксифенил)-5-имидазолил]дисульфида VI.

Соединение VI было получено из товарного 4,5-диметоксиацетофенона в соответствии со схемой, изложенной в примере 2. Желто-оранжевый порошок с т. пл. 247 251oC (с разл.). Спектр ПМР (CD3OD): 3,25 (c, 6H, 2xNMe), 3,92 (c, 6H, 2xOMe), 3,97 (c, 6H, 2xOMe), 7,12 (м, 6Наром.).

Пример 8. Получение дигидрохлорида бис[2-амино-4-(4- метоксифенил)-1-этил-5-имидазолил]дисульфида VII.

Соединение VII было получено из товарного п-метоксиацетофенона в соответствии со схемой, изложенной в примере 2, за исключением того, что на стадии конверсии фенацилбромида (39) в замещенный a-аминокетон на интермедиат (39) действовали раствором избытка этиламина в абс. C2H5OH, что давало гомологичный соединению (40) аминокетон с N-этильной группой. Желто-оранжевый порошок с т.пл. 205 209oC (с разл.). Спектр ПМР (CD3OD): 1,25 (т, J 7,1 Гц, 6Н, 2xCH2CH3, 3,67 (к, J 7,1 Гц, 4Н, 2xCH2CH3), 3,92 (c, 6H, 2xOMe), 7,07 (м, 4Наром.), 7,50 (м, 4Наром.).

Пример 9. Получение дигидрохлорида бис[2-амино-4-(4- метоксифенил)-5-тиазолил]дисульфида VIII.

Соединение VII получали в соответствии со следующей схемой 2:
Превращение фенацилбромида (39) в 2-аминотиазол (42). Раствор 1,145 г (5,0 ммоль) фенацилбромида (39) (см. пример 2) и 456 мг (6,0 ммоль) тиомочевины в 10 мл этанола кипятили в течение 3-х часов. Спирт удаляли при пониженном давлении, к остатку добавляли воду и подщелачивали конц. раствором аммиака до рН ≈ 9. Выпавший осадок отделяли, промывали водой и высушивали. Кристаллизация его из изо-пропилового спирта дала 777 мг (75%) 2-амино-4-(4-метоксифенил)тиазола (42) в виде бесцветных игл с т.пл. 189 - 191oC.


Схема 2
Конверсия тиазола (42) в бис[2-амино-4-(4-метоксифенил)-5- тиазолил] дисульфид дигидрохлорид VIII. К раствору 206 мг (1,0 ммоль) тиазола (42) в 2 мл НОАс прибавили по каплям при перемешивании 210 мг (1,5 ммоль) S2Cl2. Смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем добавили 3 мл диоксана. Выпавшее масло при перетирании частично закристаллизовалось. Смесь профильтровали, фильтрат отбросили, а остаток растворили в 3 мл метанола. Раствор профильтровали и продукт высаживали разбавлением фильтрата ≈ 40 мл эфира. Получено 229 мг (42%) соли 2-аминотиазолилдисульфида VII в виде ярко-желтого мелкого порошка с т.пл. 213 217oC (с разл.). Спектр ПМР (CD3OD, δ,, м.д. ТМС): 3,93 (c, 6H, 2xOMe), 7,13 (м, 4Наром.), 7,58 (м, 4Наром.).

Пример 10. Получение дигидрохлорида бис[2-амино-4-(3,4- диметоксифенил)-5-тиазолил]дисульфида IX.

Соединение IX было получено из товарного 3,4-диметоксиацетофенона в соответствии со схемой, изложенной в примере 9. Ярко-желтый порошок с т.пл. 238 241oC (с разл.). Спектр ПМР (CD3OD): 3,92 (c, 6H, 2xOMe), 3,94 (c, 6H, 2xOMe), 7,08 7,22 (м, 6Наром.).

Пример 11. Получение дигидрохлорида бис[2-амино-4-(4- фторофенил)-5-тиазолил/дисульфида Х.

Соединение Х было получено из товарного 4-фторацетофенона в соответствии со схемой, изложенной в примере 9. Ярко-желтый порошка с т.пл. 223 227oC (с разл. ). Спектр ПМР (CD3OD): 7,32 (т, J 8,4 Гц, 4Н, 2х2Наром.), 7,66 (дд, J 8,4 и 5,0 Гц, 4Н, 2х2Наром.).

Изучение биологической активности соединений I-X.

Биологическая активность заявляемых соединений была исследована на различных экспериментальных моделях.

Изучение цитостатического и цитотоксического действия in vitro.

Цитостатическое и цитотоксическое действие соединений I-X in vitro в отношении различных линий опухолевых клеток изучалось в отделении синтеза и химии лекарственных веществ Национального института рака (г. Бетесда, Мэрилэнд, США). Оценка цитостатического (ИД50) и цитотоксического (ЛД50) действия заявляемых соединений проводилась в соответствии с известными методиками [40,41] Чаще всего клеточная панель состояла из 60 линий, в отношении которых соединения тестировались при минимум 5-ти концентрациях, полученных путем 10-ти кратных разбавлений. Продолжительность тестирования составляла 48 часов. Результаты этих исследований сведены в табл.1. Наиболее активным среди всех изученных соединений оказалось соединение I, а наименее активным соединение Х. Аномально высокую цитостатическую активность проявили: в отношении клеток рака центральной нервной системы (линия SNB-75) соединение III (ИД50 0,02 мкг/мл) и в отношении рака легкого (линия НОР-92) соединение VII (ИД50 0,03 мкг/мл). Очень высокую цитостатическую активность (ИД50 < 0,5 мкг/мл) проявили: соединение VI в отношении клеток лейкемии (линия CCRF-CEM) и меланомы (линия UACC-257) и соединение IX в отношении клеток рака легкого (линия НОР-92) и рака предстательной железы (линия RB). Высокую цитостатическую активность (ИД50 ≅ 1,0 мкг/мл) проявили несколько изученных соединений: соединение I в отношении клеток лейкемии (линии CCRF-CEM, HL-60(TB), MOLT-4 и RPMI-8226), рака легкого (линии НОР-92, NCI-H522, KXFL 529 и DMS 114), рака прямой кишки (линии COLO 205 и SW-620), рака центральной нервной системы (линии SNB-78 и XF 498), меланомы (линии LOX IMVI, M14, M19-MEL, SK-MEL-5 и UACC-257) и рака молочной железы (линии MDA-MB-435 и MDA-N); соединение II в отношении клеток лейкемии (линия RPMI-8226), рака легкого (линии NCI-H522 и LXFL 529), рака прямой кишки (линия SW-620) и рака центральной нервной системы (линия XF498); соединение III в отношении клеток лейкемии (линия CCRF-CEM), рака легкого (линии НОР-92, NCI-H522 и LXFL 529) и рака прямой кишки (линии НСТ-116 и SW-620); соединение IV в отношении клеток лейкемии (линия CCRF-CEM) и рака молочной железы (линия MDA-MB-231/ATCC); соединение V в отношении клеток лейкемии (линии HL-60(TB) и RPMI-8226), рака легкого (линии NCI-H23 и NCI-H522), рака прямой кишки (линия НСТ-15), рака центральной нервной системы (линия SF-539), рака яичника (линия OVCAR-4) и рака молочной железы (линии MDA-MB-231/ATCC и MDA-N); соединение VI в отношении клеток лейкемии (линия MOLT-4) и рака яичника (линия OVCAR-8); соединение VII в отношении клеток лейкемии (линия CCRF-CEM) и соединение IX в отношении клеток рака прямой кишки (линия КМ12) и рака предстательной железы (линии DHM и WMF). Уровень цитостатической активности (ИД50) изученных соединений в отношении других линий опухолевых клеток колебался чаще всего в интервале 1,0 2,0 мкг/мл, то есть был тоже довольно высоким.

50%-ная Цитотоксическая активность (ЛД50) ни для одного из изученных соединений не проявлялась в дозе ниже, чем 2,5 мкг/мл. Наиболее активными цитотоксинами оказались соединения I, II, III и VI. Значения (ЛД50) этих соединений в отношении некоторых линий опухолевых клеток колебались в интервале 2,5 3,0 мкг/мл. Так, соединение I проявило высокую цитотоксическую активность в отношении клеток рака легкого (линия NCI-H522), рака центральной нервной системы (линия XF498), меланомы (линии LOX IMVI, M14 и SK-MEL-5) и рака молочной железы (линии MDA-MB-435 и MDA-N); соединение II в отношении клеток рака легкого (линия NCI-H522), рака центральной нервной системы (линия XF498) и рака яичника (линия OVCAR-5); соединение III в отношении клеток рака легкого (линия NCI-H522) и соединение VI в отношении клеток меланомы (линия UACC-257).

Высокий уровень цитотоксического действия (значения ЛД50 колебались в интервале 3,0 5,0 мкг/мл) проявили изученные соединения в отношении значительного числа линий опухолевых клеток. Так, соединение I было активным в отношении клеток лейкемии (линия MOLT-4), рака легкого (линии НОР-02, NCI-H23, LXFL529 и DMS114), рака прямой кишки (линия COLO205), рака центральной нервной системы (линия SNB-78) и меланомы (линии М19-MEL и SK-MEL-28); соединение II в отношении клеток рака прямой кишки (линия SW-620) и меланомы (линия М14); соединение III в отношении клеток рака легкого (линии НОР-92 и LXFL529), рака прямой кишки (линии НСТ-116 и SW-620), меланомы (линия SK-MEL-5), рака почек (линия RXF-393) и рака молочной железы (линия MDA-N); соединение IV в отношении клеток лейкемии (линия HL-60(TB)), рака легкого (линия NCI-H23), рака прямой кишки (линии SW-620), рака центральной нервной системы (линия SF-539), меланомы (линии М14, SK-MEL-5) и UACC-257), рака яичника (линия OVCAR-5), рака почек (линия UO-31) и рака молочной железы (линии MDA-MB-231/ATCC, MDA-MB-435 и MDA-N); соединение V в отношении клеток лейкемии (линии HL-60(TB) и RPMI-8226), рака легкого (линии НОР-92, NCI-H23 и NCI-H522), рака прямой кишки (линии COLO205, HCT-15, KM12 и SW620), рака центральной нервной системы (линии SF-539 и U251), меланомы (линии MALME-3M, M14, SK-MEL-28, SK-MEL-5 и UACC-258), рака яичника (линии OVCAR-3, OVCAR-4 и OVCAR-5), рака почек (линии 786-О, ТК-10 и UO-31) и рака молочной железы (линии MDA-MB-231/ATCC, MDA-MB-435 и MDA-N); соединение VI в отношении рака легкого (линия NCI-H23), рака прямой кишки (линии COLO205, HCT-116, HT29 и SW-620), рака центральной нервной системы (линия SF-539), меланомы (линии М14, SK-MEL-28, SK-MEL-5 и UACC-62), рака яичника (линии OVCAR-3, OVCAR-4 и OVCAR-8), рака почек (линии 786-О и UO-31) и рака молочной железы (линии MDA-MB-231/ATCC, MDA-MB-435 и MDA-N); соединение VII в отношении меланомы (линии SK-MEL-5 и UACC-257); соединение IX в отношении рака прямой кишки (линия COLO205), рака центральной нервной системы (линия SF-539), меланомы (линии М14, SK-MEL-5, и UACC-257) и рака яичника (линия OVCAR-5).

Данные табл. 1 показывают, что клеточные линии меланомной панели проявляют исключительную чувствительность к воздействию заявляемых соединений. Этот вид чувствительности необычен для соединений, проявляющих цитотоксичность посредством ингибирования топоизомеразы II. Обработка данных биоиспытаний с помощью соответствующей ЭВМ-программы показала, что модель ответа клеточных линий меланомы на воздействие поликарпина III отличается от подобной для известных ингибиторов этого фермента. Поэтому, выяснение механизма цитотоксического действия поликарпина III и других соединений этого ряда представляет, несомненно, значительный научный интерес.

Таким образом, изучение цитостатического и цитотоксического действия in vitro соединений I-X показало, что почти все они представляют собой перспективные вещества для изучения их противоопухолевого действия in vivo. Наиболее широким спектром цитостатического и цитотоксического действия обладают, как видно из табл.1, соединения I, III и V.

Испытания, проведенные в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН.

В лаборатории биоиспытаний ТИБОХ ДВО РАН соединения I-III были проверены на цитотоксическую активность в отношении мышиных лимфоцитов, а также гемолитическую и антивирусную (против вируса Сендай в первичной культуре мышиных лимфоцитов) активности в широком концентрационном пределе (от 0,1 до 100,0 мкг/мл). Исследованные соединения обладали слабой гемолитической активностью и не ингибировали связывания вируса Сендай с мышиными лимфоцитами (цитопатический эффект). В то же время они проявили выраженное цитотоксическое действие в отношении мышиных лимфобластов и опухолевых клеток (карцинома Эрлиха, асцитная форма). Слабая гемолитическая активность этих соединений свидетельствует в пользу предположения, что тестируемые вещества, по-видимому, проникают в клетки без существенных нарушений проницаемости плазматических мембран.

Определение острой токсичности поликарпина III.

Острая токсичность соединения III определялась на самцах мышей линии СВА и на белых беспородных мышах методом внутрибрюшинного введения. Навеску поликарпина III растворяли в диметилсульфоксиде и доводили до исследуемой концентрации физраствором. Концентрация ДМСО в растворе не превышала 5% Результаты испытаний представлены в табл.2.

Гибель мышей отмечалась, в основном, на вторые сутки. Характерной реакцией мышей на внутрибрюшинное введение высоких доз поликарпина явилось обездвиживание через несколько минут после введения (поза с вытягиванием мышц). Данные испытаний показывают, что поликарпин III обладает довольно высокой острой токсичностью.

Изучение цитотоксической активности поликарпина III в отношении клеток опухоли Эрлиха методом включения [3H]-тимидина в кислотонерастворимую фракцию клеток.

Оценку цитотоксической активности поликарпина III проводили согласно методике [42] Суспензию опухолевых клеток (1х105 клеток на лунку) инкубировали в течении 18 часов при 37oC в "СО2-инкубаторе" в лунках микроплейтов с разными дозами вещества III в 100 мкл среды 199, содержащей 5% эмбриональной сыворотки теленка, 5 мМ HEPES-буфера (рН 7,2), 100 ED бензилпенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, в водонасыщенной атмосфере, состоящей из 5% СО2 и 95% воздуха. За 6 часов до окончания инкубирования в каждую лунку вносили водный раствор [3H] -тимидина из расчета 0,5 мкКu на лунку. Радиоактивность проб определяли в жидкостном сцинтилляционном счетчике "Mark-II" (США). Синтез макромолекул в клетках оценивали по уровню радиоактивности и выражали в от контроля. В результате этого эксперимента было установлено, что величина 50% -ной цитотоксической активности поликарпина III in vitro в отношении суспензии опухолевых клеток Эрлиха равна 1,8 мкг/мл.

Определение противоопухолевой активности соединений III, VI, VIII и IX in vivo.

Испытания проводились на мышах линии BDF1, инокулированных внутрибрюшинно лейкозными опухолевыми клетками L1210 и P388 (из расчета 1х105-1x106 клеток на мышь), и на белых беспородных мышах, которым инокулировали внутрибрюшинно суспензию опухолевых клеток аденокарциномы Эрлиха (опухоль Эрлиха, асцитная форма) (из расчета 1х106 клеток на мышь). Противоопухолевый эффект оценивали по увеличению продолжительности жизни (УПЖ) в по сравнению с контролем по формуле:
УПЖ [(T-C)/C]x100%
где Т и С средние дни гибели животных в опытной и контрольной группах, соответственно.

Навеску тестируемых соединений растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и доводили до исследуемой концентрации физраствором. Концентрация ДМСО в растворе не превышала 5% Результаты испытаний сведены в табл.3.

Как видно из данных табл. 3, соединения III, VI, VIII и IX проявляют умеренное противоопухолевое действие in vivo в отношении представленных здесь видов опухолей, поскольку УПЖ, превышающее 25% можно считать статистически достоверным минимальным критерием активности. Проявление выраженного лечебного эффекта поликарпина III и родственных ему соединений осложняется в большинстве случаев их токсичностью для испытуемых животных.

Ингибирующее действие поликарпина III и родственных соединений в отношении некоторых ферментов
Ингибирование обратной транскриптазы
Соединение III было испытано как потенциальный ингибитор синтеза ДНК, катализируемого РНК-зависимой ДНК-полимеразой (обратной транскриптазой) вируса миелобластоза птиц. В качестве матрицы была использована активированная ДНК, полученная расщеплением ДНКазой-1 по стандартной методике. Кислоторастворимая фракция после обработки ДНКазой составляла 3 6% Как видно из чертежа поликарпин III в описанной системе интенсивно подавлял синтез ДНК (величина ИД50 0,8 мкг/мл или 3,5х10-6 M).

Следует отметить, что активность поликарпина III сильно зависит от характера системы, выбранной для испытаний: при использовании в качестве праймер-матрицы РНК (oligo dT) значение ИД50 было выше в 10 раз. Подобные эффекты неоднократно отмечались в литературе. Так, известный ингибитор ревертазы 2', 3'-дидезокси-3'-азидотимидин в системе in vitro имел ИД50 0,3 мкг/мл (10-6 M) на матрице poly(rA)-oligo(dT) и ИД50 30,0 мкг/мл (10-4 M) на активированной ДНК.

Подобный описанному выше результат был получен при использовании обратной транскриптазы, выделенной из саркомы Рауса.

Механизм действия поликарпина III пока не ясен. По аналогии с литературными данными он может конкурировать за место связывания ревертазы с праймер-матричным комплексом по типу ингибиторов ревертазы НРА23 полиоксотунгстата и сурамина или конкурировать с субстратами за связывание с ферментом, подобно антибиотику афидиколину или ингибиторам типа азидотимидина. Различная чувствительность системы к поликарпину III в зависимости от природы матрицы свидетельствует в пользу первого предположения. Не исключено также прямое влияние поликарпина III на матрицу по типу блеомицина А (ИД50 в отношении ревертазы равно 40,0 мкг/мл) или смешанный тип ингибирования.

Ингибирование Na+, K+-АТФазы мозга крыс.

Было изучено действие соединений I-III на Na+, K+-АТФазу, выделенную из мозга крыс. Исследования проводились в соответствии с ранее описанными методиками [43] В результате было установлено, что соединения I-III являются сильными ингибиторами этого фермента. Значения I50 (концентрация ингибитора, необходимая для 50%-ного ингибирования ферментативной активности) для соединений I-III составляют 4,3х10-7M, 5,2x10-7 M и 5,0х10-7 M, соответственно. Полное торможение АТФ-ной реакции происходит при концентрации ингибиторов порядка 5,0х10-5 M. Следует отметить, что степень ингибирования активности фермента зависит от его концентрации. Соединения I-III являются необратимыми ингибиторами Na+, K+-АТФазы: 10 50-кратное разбавление обработанного ими фермента не уменьшает ингибирующего действия соединений (табл.4). Торможение Na+, K+-АТФазной активности зависит от времени преинкубации фермента с ингибитором. В течение первых пяти минут реакция взаимодействия фермента с ингибиторами I-III подчиняется псевдо-первому порядку с константами модификации (K') равными 0,070, 0,055 и 0,060 мин-1•мкМ-1, соответственно.

Ингибирование достигает постоянного значения в течение 15 мин. Ингибирующий эффект соединений I-III зависит от рН среды. Максимальное проявление ингибирующего действия наблюдается при значениях рН от 8,0 до 9,0. Na2АТФ (субстрат Na+, K+-АТФазы (защищает фермент от действия соединений I-III. 50% -ный защитный эффект наблюдается при концентрации субстрата 5,0 мМ.

Таким образом, изложенные выше результаты исследования биологической активности заявляемых соединений показывают, что эти соединения обладают, как правило, высокой цитостатической и цитотоксической активностью in vitro, проявляют выраженное противоопухолевое действие in vivo и являются эффективными ингибиторами таких ферментов, как обратная транскриптаза и Na+, K+-АТФаза.

Заявляемые соединения потенциально пригодны для создания на их основе эффективных противоопухолевых средств, которые могут найти применение в медицине для лечения различных злокачественных опухолей человека.

Похожие патенты RU2076864C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗАМЕЩЕННЫХ 2,3,5,8-ТЕТРАГИДРОКСИ-1,4-НАФТАХИНОНОВ 1990
  • Ануфриев В.Ф.
  • Новиков В.Л.
RU2022959C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УГЛЕВОД-БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ПРИМОРСКОГО ГРЕБЕШКА 1996
  • Ковалевская А.М.
RU2121844C1
СРЕДСТВО, ПРЕДОТВРАЩАЮЩЕЕ ТРАНСФОРМАЦИЮ НОРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ В ОПУХОЛЕВЫЕ 2010
  • Дышловой Сергей Анатольевич
  • Шубина Лариса Кимовна
  • Федоров Сергей Николаевич
  • Кузьмич Александра Сергеевна
  • Радченко Олег Сергеевич
  • Красохин Владимир Борисович
  • Стоник Валентин Аронович
RU2429840C1
ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ХИНОНЫ 2005
  • Федоров Сергей Николаевич
  • Боуд Анна М.
  • Донг Зиганг
  • Радченко Олег Сергеевич
  • Шубина Лариса Кимовна
  • Стоник Валентин Аронович
RU2411229C2
СРЕДСТВО, ПРЕДОТВРАЩАЮЩЕЕ ТРАНСФОРМАЦИЮ НОРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ В ОПУХОЛЕВЫЕ 2010
  • Кузьмич Александра Сергеевна
  • Федоров Сергей Николаевич
  • Шубина Лариса Кимовна
  • Радченко Олег Сергеевич
  • Жидков Максим Евгеньевич
  • Баланева Надежда Николаевна
  • Стоник Валентин Аронович
RU2429839C1
СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2001
  • Ковалевская А.М.
  • Стоник В.А.
  • Гришин Ю.И.
RU2184556C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИТЕРПЕНОВОГО ГЛИКОЗИДА 3 - 0 - β - D-ГЛЮКОПИРАНОЗИЛ- (1 _→ 2) -α - Z- АРАБИНОПИРАНОЗИДА ХЕДЕРАГЕНИНА 1994
  • Стригина Л.И.
RU2064934C1
СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЛУЧЕВОЙ БОЛЕЗНИ 1997
  • Ковалевская А.М.
  • Стоник В.А.
RU2141833C1
ТЕСТ ДЛЯ ИНТЕГРАЛЬНОЙ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ МОРСКОЙ И ПРЕСНОЙ ВОДЫ 1997
  • Мензорова Н.И.
  • Рассказов В.А.
RU2131925C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОВОИНГИБИТОРА 1997
  • Швец Т.В.
  • Козловская Э.П.
RU2129438C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 076 864 C1

Реферат патента 1997 года ГИДРОХЛОРИДЫ СЕРОСОДЕРЖАЩИХ 2-АМИНОИМИДАЗОЛОВ ИЛИ 2-АМИНОТИАЗОЛОВ, ОБЛАДАЮЩИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ И ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ И ПРОЯВЛЯЮЩИЕ ИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ В ОТНОШЕНИИ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к органической химии, а точнее к новым соединениям - гидрохлоридам 2-аминоимидазолов и 2-аминотиазолов общей формулы (1),

содержащим арильный заместитель в положении 4 и дисульфидный мостик в положении 5, где Х-алкиламиногруппа, например, метиламино, а R1-R2-водород; Х-метиламиногруппа, а R1-алкил, например, метил и R2-водород; Х-метиламиногруппа, а R1-алкоксигруппа, например, метокси и R2-водород; Х-метиламиногруппа, а R1-этоксигруппа и R2-водород; Х-метиламиногруппа, а R1-галоген, например, хлор и RF2-водород; Х-метиламиногруппа, а R1-R2-алкоксигруппа, например, метокси; Х-этиламиногруппа, а R1-алкоксигруппа, например, метокси и R2-водород; Х-сера, а R1-алкоксигруппа, например, метокси и R2-водород; Х-сера, а R1-R2-алкоксигруппа, например, метокси; Х-сера, а R1-галоген, например, фтор и R2-водород. Новые соединения обладают цитотоксической и противоопухолевой активностью и проявляют ингибирующее действие в отношении некоторых ферментов. 1 ил., 4 табл.

Формула изобретения RU 2 076 864 C1

Гидрохлориды серосодержащих 2-аминоимидазолов или 2-аминотиазолов общей формулы I

где Х алкиламиногруппа, например метиламино, а R1 R2 - водород;
Х метиламиногруппа, а R1 алкил, например метил, и R2 - водород;
Х метиламиногруппа, а R1 алкоксигруппа, например метокси, и R2 водород;
Х метиламиногруппа, а R1 этоксигруппа и R2 водород;
Х метиламиногруппа, а R1 галоген, например хлор, и R2 - водород;
Х метиламиногруппа, а R1 R2 алкоксигруппа, например метокси;
Х этиламиногруппа, а R1 алкоксигруппа, например метокси, и R2 водород;
Х сера, а R1 алкоксигруппа, например метокси, и R2 - водород;
Х сера, а R1 R2 алкоксигруппа, например метокси;
Х сера, а R1 галоген, например фтор, и R2 водород,
обладающие цитотоксической и противоопухолевой активностью и проявляющие ингибирующее действие в отношении некоторых ферментов.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1997 года RU2076864C1

Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Механизм для сообщения поршню рабочего цилиндра возвратно-поступательного движения 1918
  • Р.К. Каблиц
SU1989A1
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Hard C.D., Wehrmeister H.L
J.Amer.Chem
Cos
Автоматическое или полуавтоматическое телефонное устройство 1925
  • Г.А. Бетуландер
  • Пальмгрен Н.Г.
SU1949A1

RU 2 076 864 C1

Авторы

Новиков Вячеслав Леонидович[Ru]

Радченко Олег Сергеевич[Ru]

Федореев Сергей Александрович[Ru]

Попов Александр Михайлович[Ru]

Шестак Ольга Петровна[Ru]

Горшков Борис Александрович[Ru]

Стоник Валентин Аронович[Ru]

Еляков Георгий Борисович[Ru]

Мэрфи Петер Томас[Au]

Виллис Ричард Гарольд[Au]

Бейкер Джозеф Томас[Au]

Даты

1997-04-10Публикация

1995-07-31Подача