НУКЛЕОТИДОПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1997 года по МПК C07K9/00 C12P21/02 

Изобретение относится к области органической химии, к антибактериальным средствам и может найти применение в медицине и ветеринарии.

Известно антибактериальное средство антибиотик муреидомицин, продуцентом которого является микроорганизм Streptomyces flavidovirence (Journal of Antibiotics, 1989 v. XLII, N5, p. 667 673.)
Однако известное антибактериальное средство имеет узкий спектр действия и не оказывает действия на микроплазму.

Известно антибактериальное средство антибиотик небуларин формулы I

Продуцентом данного известного антибактериального средства является культура Streptomyces (Journal of Antibiotics, Ser A, 1960, v.XIII, p. 270 - 272).

Однако данный известный антибиотик имеет также узкий спектр действия и не активен против микроплазмы.

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является получение нового антибактериального средства широкого спектра действия, в том числе и на микроплазмы.

Достигается это тем, что нуклеотидопептид общей формулы II


рекомендуется в качестве нового антибактериального средства широкого спектра действия.

На фиг. 1 представлен одномерный протоновый ЯМР-спектр нового средства в D₂O.

На фиг. 2 представлен двумерный гетероядерный корреляционный ¹H/³¹P-ЯМР спектр нового средства.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.

Пример 1. Клетки продуцента нового нуклеотидпептида E. Coli TG1 pNK34 выращивали в чашках Петри в мягкой агаризованной (0,7% агара) минимальной среде M63 [В 1 л среды 1% глицерина, KH₂PO₄ 13,6 г. (NH₄)₂SO₄-2,0 г; FeSO₄ 7H₂О-0,5 мг; 1 мM MgSO₄; B₁-1 мкг/мл] Нижний слой представлял собой ту же среду, но содержащую 1,2% агара. Теплую среду разливали в чашки Петри и после застывания накрывали ее листом целлофана. В мягкую верхнюю среду, охлажденную до 42^oC, вносили суспензию ночной культуры Escherichia coli TG1 pNK34, выращенной в жидкой среде M63. Чашки инкубировали в течение 48 ч при 37^oC. Верхний слой вместе с целлофаном выбрасывали. Нижний слой агара замораживали при -70^oC и после оттаивания центрифугировали при 18000g.

Полученный центрифугат (нативный раствор нуклеотидпептида) анализировали методами TCX на силикагеле, электрофореза на бумаге (pH 2,4), и установили, что антибактериальная активность связана с высокополярным веществом, которое окрашивается бензидином, дифениламином и анилинфталатом, но не дает реакции с нингидрином. Антибактериальная активность не сохраняется под действием трипсина, химотрипсина, субтилизина, но сохраняется после воздействия термолизина и карбоксипептидаз B и Y.

Пример 2. Высокополярное вещество с высокой антибактериальной активностью выделяли из центрифугата питательной среды, полученного по примеру 1. Выделение и очистку целевого продукта проводили с использованием ионообменной хроматографии на СДВ-3 (Олайне, Латвия), хроматографии на гидрофобном сорбенте МПС (Россия) и на конечном этапе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (колонка Zorbax ODS C-18, Du Pont).

Для определения структуры нового антибактериального средства использовали методы TCX, электрофореза на бумаге (pH 2,4), фрагментацию протеолитическими ферментами (трипсин, субтилизин, проназа), выделение полученных фрагментов методом ВЭЖХ и определение их аминокислотного состава и последовательности. Молекулярную массу фрагментов определяли путем масс-спектрометрии методом пламенной десорбции. Определяли спектры поглощения фрагментов в УФ и видимой области. Для окончательного определения структуры нового антибактериального средства была использована одно- и двумерная гомо- и гетероядерная ЯМР-спектроскопия.

Определение аминокислотного состава показало присутствие в антибиотике 6 аминокислот. За единицу взято содержание аланина. При этом содержание аминокислот было следующим: Ala-1,0; Arg-1,11; Asp-2,2; Gly-1,02; Met-0,95; Thr-1,1).

При гидролизе нового антибактериального средства трипсином образуются два основных фрагмента, обозначенных: T1 и T2. С помощью автоматического анализатора показано, что Фрагмент T1 содержит Arg и Met, не окрашивается нингидрином и не имеет максимума поглощения при 258 нм. Его молекулярная масса, измеренная методом ПМДС, равна 333,9 Да. Данные масс-спектроскопического анализа и гидрофобный характер фрагмента T1 дают основание считать, что N конец пептида представлен формилметионином. В спектре ¹H-ЯМР раствора нового нуклеотидпептида в диметилсульфоксиде был виден сигнал при 12,2 м.д. характерный для резонанса альдегидных протонов.

Фрагмент T2 с молекулярной массой 862,0 представляет собой пентапептид со следующей последовательностью аминокислот: Thr-Gly-Asn-Ala-Asx, где по данным масс-спектрометрии и ЯМР N-концевой Thr модифицирован и содержит остаток гидроксиламина. УФ-спектр T2 имеет максимумы при 200 и 258 нм.

Таким образом, последовательность аминокислот пептидной части антибиотика можно представить следующим образом: Met-Arg-Thr-Gly-Asn-Ala-Asx.

При анализе методом масс-спектрометрии и УФ-спектроскопии фрагментов нового антибактериального средства, полученных при действии протеолитических ферментов, показано наличие ароматической группировки на C-конце гептапептида. Среди продуктов гидролиза нового антибактериального средства методом электрофореза на бумаге обнаружили N-амино-1-пропанол.

Результаты углеводного анализа гидролизата нового антибактериального средства (ЗМ трифторуксусная кислота, 105^oC) свидетельствуют о присутствии одного остатка рибозы на пептидную цепь. Молекулярная масса нового средства, определенная методом ПМДС, равна 1178 Да. В его УФ-спектре поглощения имеются максимумы 200 и 258 нм. В кислой и щелочной среде наблюдаются изменения спектра, характерные для производных пурина. Природа нуклеотида следует из анализа спектра ЯМР. В ¹H-ЯМР спектре присутствуют три однопротоновых синглета в области резонанса ароматических протонов с химическими сдвигами 8,18; 8,40; 8,44 м. д. и набор сигналов рибофуранозного остатка с химическими сдвигами H-1 6,20 м. д. (Y_1,2= 8,0 Гц); H-2 4,80 м.д. (Y_2,3= 8,6 Гц); H-3 4,51 м.д. (Y_3,4 4,0 Гц); H-4 4,43 м.д. H-5' 4,49 м.д. и H-5 4,43 м.д. Анализ гетероядерного ¹H/¹³C HMQC спектра показал, что в спектре ¹³C-ЯМР рибозному остатку отвечают сигналы C-1 89,2 м.д. C-2 75,2 м.д. C-3 71,0 м.д. C-4 83,8 м. д. (дублет 8 Гц) и C-5 68,1 м.д. J 4 Гц). Расщепление последних двух сигналов в углеродном спектре очевидно связано с локализацией остатка фосфорной кислоты при C-5 рибозы. Наличие фосфодиэфирного остатка в молекуле нового антибактериального средства подтвердилось спектром ³¹P-ЯМР, где присутствует единственный сигнал с химическим сдвигом -0,2 м.д. Двумерный гетероядерный COCY спектр ³¹P/¹H подтвердил локализацию остатка фосфорной кислоты при C-5 рибозы. В этом же спектре имелся сигнал в координатах химического сдвига -0,2 м.д. в шкале фосфорных химических сдвигов и 4,23 м.д. в шкале протонных химических сдвигов. В одномерном протонном спектре этому химическому сдвигу отвечает уширенный триплет с KCCB 5 Гц. Гомоядерный ¹H/¹H COSY спектр показал корреляцию последнего пика с квинтетом при 2,09 м.д. который, в свою очередь, имеет константу с триплетом при 4,47 м.д. Все перечисленные сигналы имели двухпротонную интегральную интенсивность, то есть относились к CH₂- группам. В углеродном спектре им отвечали сигналы 67,1 м.д. (дублет с KCCB J_31p-13c 4 Гц); 28,5 м.д. (дублет J_31p-13c 8 Гц) и 54,5 м.д. (синглет). Таким образом, нуклеотид представлен остатком небуларина, связанного фосфодиэфирной связью по C'-5 рибозы с остатком 3-амино-1-пропанола. Судя по химическому сдвигу атома углерода, несущего аминогруппу (54,5), последняя должна быть алкилирована или ацилирована.

Таким образом, новое антибактериальное средство представляет собой нуклеотидопептид, в котором пептидная часть представлена гептапептидом со следующей последовательностью аминокислот: формил-метионил-аргинил-(ONH₂)треонил глицил-аспарагинил-аланил-аспарагин, при этом аминогруппа C-концевого аспарагина через пропанол соединена фосфодиэфирной связью с рибозным остатком небуларина формулы I. Новое антибактериальное средство имеет строение общей формулы II.

Пример 3. Изучен спектр антибактериального действия нового средства. Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о широком спектре действия нового средства не только на многие грамположительные и грамотрицательные бактерии, но и на микроплазму.

Таким образом, новый нуклеотидопептид общей формулы II является антибактериальным средством широкого спектра действия (см. таблицу).

Использование: в органической химии, медицине, ветеринарии. Сущность изобретения: из питательной среды для выращивания культуры бактерий EScherichia coli TG 1 pNK34 выделено новое антибактериальное средство широкого спектра действия общей формулы, приведенной в описании. 1 табл., 2 ил.

Нуклеотидопептид общей формулы




Gly -NH-CH₂-CO-;



обладающий антибактериальной активностью широкого спектра действия.