СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦИСТЕИНОВЫХ КАТЕПСИНОВ ИЗ ЭКСТРАКТОВ ТКАНЕЙ Российский патент 1999 года по МПК A61K35/23 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии, и может быть использовано для выделения цистеиновых катепсинов из экстрактов тканей.

Известен способ выделения цистеиновых катепсинов из селезенки человека (Baici A., Gyger-Marazzi M. The slow, tight-binding inhibition of catepsin B by leupeptin // Eur. J.Blol.Chem.- 1982.- V. 129, N 1.- p. 33-41). Способ включает последовательную кислотную обработку экстракта (pH 4,5), фракционирование сульфатом аммония (38-70% насыщения) и фракционирование ацетоном (30-60%). Выход фермента составляет 65% при степени очистки 80.

Известен способ выделения цистеиновых катепсинов (Okitani A., Matsulchi M. et al. Purification and some properties of cathepsin В from rabbit skelet muscle//Eur.J.Blol.Chem. - 1988. - V. 171, N 1-2. p. 377-381) путем кислотной обработки гомогената ткани с последующим фракционированием экстракта сульфатом аммония (25-65% насыщения). Выход фермента составляет 56%.

Известен способ выделения цистеиновых катепсинов (Щербак И.Г., Жлоба А. А. Активация катепсина В восстановленными формами пиридиннуклеотидов и тиоловыми соединениями. Биохимия. 1979. т. 44, N 12. с. 2218-2226), в котором осуществляют инкубацию гомогената ткани почки человека в кислой среде (pH 4,2) с последующим фракционированием полученного экстракта сульфатом аммония. Для дальнейшей очистки используется фракция, осаждающаяся между 40 и 70% насыщения сульфатом аммония. На этом этапе выход цистеиновых катепсинов составляет 30% от их содержания в экстракте при 85-кратной очистке.

Недостатком прототипа является низкий выход ферментов. Кроме этого, требуется неоднократное центрифугирование больших объемов жидкости (800 - 1000 мл и более), что делает способ достаточно трудоемким.

Задачей изобретения является разработка простого, нетрудоемкого способа выделения цистеиновых катепсинов с высоким выходом ферментов.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе выделения цистеиновых катепсинов из экстрактов тканей, включающем кислотную обработку экстракта, согласно изобретению дополнительно проводят ионообменную хроматографию.

В предлагаемом способе стадию фракционирования экстракта сульфатом аммония заменяют ионообменной хроматографией на катионообменнике. Перемешивание экстракта с суспензией катионообменника при pH 4,0-4,4 приводит к полному связыванию всех цистеиновых катепсинов с ионообменником, после чего заполняют колонку и отмывают ее тем же буфером (pH 4,0-4,4), а затем элюируют ферменты буфером с pH 5,4-5,8, содержащим NaCl. За счет ионообменной хроматографии достигается существенное увеличение выхода ферментов 130-160%, что превышает суммарную активность, регистрируемую в исходном экстракте. Это, очевидно, связано с тем, что в процессе элюции происходит диссоциация комплексов ферментов с эндогенными ингибиторами. В аналогах этот эффект отсутствует, поскольку неактивные фермент-ингибиторные комплексы удаляются в процессе нескольких стадий осаждения.

Способ может быть осуществлен следующим образом. Экстракт ткани, предварительно подвергнутый кислотной обработке, в течение 30-60 мин перемешивают на магнитной мешалке при 4^oC с суспензией катионообменника при pH 4,1-4,3. Постоянство pH достигается предварительным суспендированием ионообменного полимера в 0,2 М ацетатном буфере pH 4,2, содержащем 1 мМ ЭДТА. Соотношение объемов экстракта и суспензии составляет 10 : 1. Полученной смесью заполняют колонку подходящего размера. Отмывание балластных белков осуществляют тем же буфером. Задержанные колонкой белки элюируют 0,2 М ацетатным буфером pH 5,6, содержащим 0,2 М NaCl и 1 мМ ЭДТА. Выделяемые катепсины выходят с первым белковым пиком в довольно узкой зоне. После объединения фракций, содержащих ферментативную активность, возможно проведение дальнейшего фракционирования ацетоном (30-60%), что позволяет дополнительно увеличить степень очистки.

Способ иллюстрируется следующим примером.

Пример. Из трупной почки человека удаляют жировую и соединительную ткань, лоханки, крупные сосуды. Почечную ткань разрезают на тонкие пластинки и тщательно отмывают от остатков крови в 0,9% растворе NaCl. Эту и все последующие процедуры проводят при 4^oС. Вес отмытой почечной ткани составил 130 г. Далее производят гомогенизацию в экстрагирующей жидкости следующего состава: 0,01 М фосфатный буфер pH 6,0, содержащий 4 мМ ЭДТА, 2 об% бутанола и 0,2% Тритона Х-100. Соотношение веса ткани и экстрагирующей жидкости может быть 1: 3-1:4, в данном случае взято 400 мл жидкости. Экстракцию проводят в течение 18-20 часов при постоянном помешивании. Затем pH гомогената доводят до 4,2 с помощью 1н. раствора HC1 и перемешивают еще 60 мин., после чего гомогенат центрифугируют при 10 000 g в течение 30 мин. Надосадочную жидкость (экстракт) объемом 430 мл подвергают ионообменной хроматографии. Для этого к экстракту добавляют 40 мл суспензии целлюлозы КМ-32 в 0,2 М ацетатном буфере (pH 4,2), содержащем 1 мМ ЭДТА. Смесь перемешивают в течение 60 мин и заполняют ею колонку размерами 2,3 см•10 см. Отмывание балластных белков осуществляют пропусканием буферного раствора того же состава. Элюцию задержанных в колонке белков производят 0,2 М ацетатным буфером (pH 5,6), содержащим 0,2 М NaCl и 1 мМ ЭДТА. Скорость элюции составляет 30-40 мл/час. Собрано 40 фракций по 4 мл. Ферментативную активность определяют спектрофотометрически по субстрату БАПНА (2 мм) при 37^oС в 0,2 М цитратном буфере (pH 6,0), содержащем 4 MM ЭДТА и 5 мМ цистеин. Активность выявлена во фракциях от 15-й до 22-й. Объем объединенных фракций 32 мл. Для увеличения степени очистки препарат подвергают затем фракционированию ацетоном. Осадок, полученный в диапазоне от 30% до 60% ацетона, растворяют в минимальном количестве ацетатного буфера (pH 5,0) и подвергают диализу. Он может быть использован для дальнейшей более тщательной очистки. Результаты определения активности цистеиновых катепсинов после ионообменной хроматографии по заявляемому способу и после дальнейшего фракционирования ацетоном представлены в таблице.

Таким образом, способ позволяет получить существенное увеличение выхода ферментов до 150%. При повышении степени очистки в 47,5 раза путем фракционирования ацетоном общий выход ферментов 143%. Как отмечалось выше, существенное повышение выхода связано, очевидно, с феноменом освобождения активных ферментов из их комплексов с эндогенными ингибиторами, происходящим в ходе ионообменной хроматографии.

Способ выделения цистеиновых катепсинов из экстрактов тканей позволяет существенно увеличить выход ферментов до 130-160%, не требуя при этом повторных центрифугирований больших объемов жидкости. Кроме того, уменьшается стоимость процедуры за счет исключения применения больших количеств сульфата аммония.

Способ выделения цистеиновых катепсинов из экстрактов тканей включает кислотную обработку экстракта и ионообменную хроматографию. За счет этого достигается существенное увеличение выхода ферментов - до 130%-160%, что превышает суммарную активность, определявшуюся в экстракте. Уменьшается также трудоемкость процедуры за счет исключения повторных центрифугирований больших объемов жидкости. 1 табл.

Способ выделения цистеиновых катепсинов из экстрактов тканей, включающий кислотную обработку экстракта, отличающийся тем, что после кислотной обработки проводят ионообменную хроматографию.