СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ ПРОТИВОМОЗГОВЫХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/553 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, может быть использовано в диагностике нейроонкологических, сосудистых, демиелинизирующих, травматических, инфекционных заболеваний центральной нервной системы, эпилепсии и гидроцефалии. При этих заболеваниях возникает кратковременное или стойкое повышение проницаемости ГЭБ и контакт иммунокомпетентных клеток крови с мозговой тканью, что обусловливает выработку противомозговых антител.

Эти антитела могут обнаруживаться в периферической крови, однако до настоящего времени не созданы диагностические препараты, позволяющие осуществлять данную процедуру бесприборно. Отсутствуют надежные и простые методы для скринингового исследования больных, относящихся к группам риска в плане развития прогредиентного аутоиммунного конфликта против ткани мозга, что важно для коррекции терапии и определения прогноза заболевания.

Цель изобретения - разработка экспресс-метода для определения наличия и титра противомозговых антител в сыворотке крови неврологических и нейрохирургических больных.

Аналогом данного метода является способ определения антител против вируса клещевого энцефалита в сыворотке крови с помощью реакции непрямой гемагглютинации (Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. -Кишинев,1982.-304 с.)
Аналогом данного метода является также способ определения антирезусных антител при аутоиммуногемолитической анемии (Никитин В. М. Справочник методов иммунологии. -Кишинев, 1982.-304 с.) с помощью прямой реакции гемагглютинации антиглобулином.

Прототипом данного технического решения является способ определения противомозговых антител в сыворотке крови реакцией пассивной гемагглютинации (Горбунов В. И., Лихтерман Л. Б., Ганнушкина И. В. Иммунопатология травматической болезни головного мозга. -Ульяновск, 1996. 528 с.).

Данный способ предусматривает приготовление 2,5% взвеси эритроцитов барана в солевом буферном растворе (pH 7,2) при добавлении равного объема танина (1:20000). Смесь инкубируют при 37^oC в течение 10 минут, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 минут, после чего надосадочную жидкость удаляют, а эритроциты отмывают физиологическим раствором и готовят 2,5% взвесь в солевом буферном растворе с pH 6,4. Танизированные эритроциты соединяют с мозговыми антигенами в равных объемах и помещают на 30 минут в термостат при 37^oC. На 1 мл взвеси эритроцитов должно приходиться 4,5 мкг мозгового белка.

После инкубации эритроциты дважды отмывают от избытка антигена раствором кроличьей сыворотки на физиологическом растворе (1:250); готовят 2,5% взвесь эритроцитов в том же растворе.

Исследуемая сыворотка больных разводится раствором нормальной кроличьей сыворотки (1:100) от 1:2 до 1:512 в объеме 0,5 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют 0,25 мл взвеси эритроцитов. Смесь инкубируют 2 часа при температуре 37^oC. Оценку результатов проводят визуально или микроскопируя осадок. Определяют титр реакции. Положительным результатом считается наличие агглютинации в разведении 1:8 и выше.

Недостатками прототипа можно считать:
а) возможность реагирования антител не с антигенами мозга, а с самими эритроцитами;
б) многоэтапность и длительность приготовления реактивов;
в) нестойкость приготовленных реактивов;
г) необходимость специального оборудования для постановки реакции;
д) необходимость использования больших объемов биологических жидкостей.

К преимуществам можно отнести возможность достоверной и технически относительно простой диагностики наличия противомозговых антител в сыворотке крови.

Указанные недостатки прототипа преодолеваются, если в качестве диагностикума используют гидрозольный препарат на основе неорганических оксидов металлов, в частности оксида трехвалентного железа, на поверхности которого сорбируется биоспецифический антиген для детекции противомозговых антител.

Предложенный нами метод предусматривает взятие небольшого (не более 0,1 мл) объема крови, вследствие чего появляется возможность постановки реакции не только с кровью, полученной при венепункции, но и с капиллярной кровью, что создает преимущества при амбулаторной диагностике, при проведении анализа у детей, у тяжелых больных с кахексией.

Полученная кровь центрифугируется для осаждения форменных элементов.

В состав набора входят гидрозоль на основе оксида трехвалентного железа с сорбированным на его поверхности антигеном мозговой ткани, буфер для разведения проб, планшеты со скошенным дном, положительные и отрицательные сыворотки.

В лунках планшета готовятся разведения сыворотки больных в титре от 1:2 до 1:128 при добавлении к сыворотке больных буфера для разведения проб. Затем в каждое разведение добавляется 40 мкл гидрозольного препарата оксида железа с сорбированным мозговым антигеном. После инкубации в термостате при 37^oC в течение 20 минут производится визуальная оценка реакции или микроскопия осадка. Положительной реакцией считается наличие агглютинации в разведении 1:8 и выше.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами клинического применения.

У 53 больных с опухолями головного мозга различной гистологической структуры (глиобластомы и анапластические астроцитомы, дифференцированные астроцитомы, менингиомы и невриномы) проведено исследование уровня противомозговых антител в дооперационном периоде, а также на 3-5 и 8-10 сутки после операции. В качестве контрольной группы рассматривались больные с остеохондрозом поясничного отдела позвоночника, не имевшие в анамнезе эпизодов черепно-мозговой травмы, нарушений мозгового кровообращения, эпилептических приступов.

При постановке реакции пассивной агглютинации с сывороткой крови больных контрольной группы положительный результат в диагностическом титре 1:8 отмечен у 4 из 25 больных с остеохондрозом поясничного отдела позвоночника (16,00%). В то же время, подобное исследование, проведенное в дооперационном периоде у 16 больных с анапластическими астроцитомами и глиобластомами головного мозга дало положительный результат в 13 случаях (81,25%), у 10 больных с дифференцированными астроцитомами - в 6 случаях (60,00%), у 12 больных с менингиомами - в 5 случаях (41,66%), у 14 больных с невриномами слухового нерва - в 9 случаях (64,28%). В период 3-5 суток послеоперационного периода реакция пассивной агглютинации с использованием приготовленного нами мозгового антигена была положительна в титре сыворотки 1:8 и выше у 14 из 14 больных с анапластическими астроцитомами и глиобластомами (100%), у 8 из 10 больных с дифференцированными астроцитомами (80,00%), у 11 из 12 больных с менингиомами (91,66%), у 11 из 11 больных с невриномами слухового нерва (100%). В период 8-10 суток послеоперационного периода реакция была положительной у 13 из 14 больных с анапластическими астроцитомами и глиобластомами (92,85%), у 9 из 10 больных с дифференцированными астроцитомами (90%), у 11 из 12 больных с менингиомами (91,66%), у 11 из 11 больных с невриномами слухового нерва (100%).

Представленные результаты указывают на возможность использования предложенного способа в диагностике наличия, титра, и динамических изменений уровня противомозговых антител, что отражает фазные изменения проницаемости гематоэнцефалического барьера и аутоиммунных реакций против мозговой ткани в разные периоды заболевания головного мозга. Полученные данные могут иметь важное значение в диагностике, определении прогноза заболевания и коррекции лечения неврологических и нейрохирургических больных.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения противомозговых антител в сыворотке крови больных с глиальными опухолями, менингиомами и невриномами головного мозга. Способ основан на постановке реакции пассивной агглютинации. При этом в качестве носителя антигенов головного мозга используют гидрозольный препарат оксида трехвалентного железа. Способ позволяет избежать наличия ложноположительных результатов, упростить и ускорить постановку реакции иммуноагглютинации, использовать меньший объем сыворотки крови больного.

Способ определения наличия противомозговых антител в сыворотке крови, включающий постановку реакции пассивной агглютинации, отличающийся тем, что носителем сорбированного антигена мозговой ткани является гидрозольный препарат оксида трехвалентного железа, что позволяет диагностировать наличие и титр иротивомозговых антител в сыворотке крови.