СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2001 года по МПК C12N13/00 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в бактериологических исследованиях микроорганизмов в объектах внешней среды и восстановлении штаммов, частично утративших свою жизнеспособность.

Проблема выделения жизнеспособных возбудителей при микробиологических исследованиях различных объектов, несмотря на успешное развитие молекулярных диагностических методов, остается актуальной.

Жизнеспособность микроорганизмов определяется их генетической способностью к росту, биосинтезу, сохранению специфической морфологической структуры.

Этим обусловлены общепринятые в микробиологии способы культивирования микроорганизмов, предусматривающие оптимальные режимы их роста.

Известно, что при диагностике возбудителей особо опасных инфекционных болезней (чума, сибирская язва и др.) одновременно с микроскопическим исследованием производят посев материала на элективные питательные среды, содержащие ингибиторы, стимуляторы, стабилизаторы, способствующие выделению культур [Диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней. Т. 1, 2, Саратов, 1998].

Однако в процессе культивирования исследуемого материала не все клетки участвуют в образовании колоний, так как не происходит стимуляции клеток с низкой степенью жизнеспособности.

Известен способ культивирования возбудителей чумы, сибирской язвы, который предусматривает подкожное введение биопробным животным исследуемого материала, смешанного со стимуляторами роста, ингибиторами роста посторонней микрофлоры и исследование патологического материала с места введения [пат. РФ N 2012595, C 12 Q 1/04, C 12 N 1/00, 15.05.94, Бюл. N 9; пат. РФ N 2077591, C 12 Q 1/04, G 01 N 33/569, 20.04.97, Бюл. N 11].

Способ обеспечивает выделение возбудителей инфекций при единичном содержании микробных клеток в пробах, загрязненных посторонней микрофлорой за счет оптимальных условий генерализованного процесса размножения микробных клеток.

Однако этот способ требует затрат по трудоемкости и расходу биопробных животных.

Наиболее близким к заявляемому по назначению и совокупности используемых приемов является способ культивирования одного из возбудителей особо опасных инфекционных болезней (чумы) [Диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней. Т. 1, Саратов, 1998, с. 7-9].

Способ включает посев исследуемого материала на высокопитательные агары, например, Хоттингера, Мартена с сульфитом натрия в качестве стимулятора и генцианвиолетом в качестве ингибитора в случае материала, загрязненного посторонней микрофлорой. Посевы культивируют при 28-30^oC, контроль образования колоний осуществляют начиная с 16-18 часов с начала инкубирования до 5 суток.

Недостатком способа является неполный рост микробных клеток, что является следствием недостаточной стимуляции их жизнедеятельности.

Целью изобретения является повышение роста микроорганизмов в количественном выражении за счет стимуляции их жизнеспособности.

Поставленная цель достигается тем, что суспензию исследуемого материала в электролите однократно обрабатывают электрическим полем мощностью (1,0-1,2)·10⁸ Вт/м³ в течение 2-3 с, затем высевают на плотную питательную среду, содержащую стимуляторы и в случае необходимости ингибиторы роста, инкубируют с последующим учетом образования колоний.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки. Однократная обработка суспензии исследуемого материала в электролите электрическим полем мощностью (1,0-1,2)·10⁸ Вт/м³ в течение 2-3 с.

Такая обработка повышает интенсивность роста микробных клеток на 50-100% за счет стимуляции их жизнеспособности.

Метод стимуляции жизнеспособности микроорганизмов электрическим полем является практическим использованием результатов многочисленных исследований электрических свойств биологических тканей, влияние условий внешней среды на молекулярно-генетические механизмы регулирования вирулентности, связи сигналов генной активности и взаимодействия биомакромолекул под влиянием электрического поля [Литвин В.Ю., Гинзбург А.Л., Пушкарева В.И., Романова Ю. М. , Боев В. В. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. - М.: Фарма Рус-Принт, 1998, 256 с.; Wenjun S., Forde B.Е. Efficient transformation of agrobacterium ssp. by high voltage electroporation// Nucl. Acids Res. - 1989. - V. 17. - N 20. - P.83-85; Глорин М.В., Лившиц В.А. Некоторые практические аспекты электротрансформации бактерий// Биол. мембраны. - 1994. - Т. 11 , N 4. - С. 117-139].

Установлено, что при переходе клеток из функционально-активного состояния в стадию некробиотических изменений и аутолиза одними из первых подвергаются патологическим изменениям клеточные мембраны. С этих позиций при изучении электрических свойств биологических тканей применяли метод импедансной плетизмографии, основанный на отличии сопротивления тканей, находящихся в разном функциональном состоянии, внешнему источнику тока. При использовании этого метода электрическую цепь внешнего источника тока образуют ткани, состоящие из клеток, межклеточного вещества и волокон, представляющих в совокупности коллоидную систему и со сформированными основными каналами проводимости.

С помощью импедансометрии разработан метод определения давности наступления смерти [Сергиенко Т.М. Вопр. нейрохирургии. 1989, N 3, с. 47-49].

Возможность практического применения заявленного способа иллюстрируется примерами его применения с использованием полной совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Для культивирования брали вакцинный штамм Y. pestis EV, непригодный к использованию по срокам действия, проводили его разведение трис-ацетатным буферным раствором pH 8,0 (электролит) и 1:10, затем разливали его на две пробирки (контроль и опыт). В опытную пробирку опускали электроды и воздействовали на испытуемую культуру электрическим полем мощностью 1 · 10⁸ Вт/м³ в течение 3 с. Готовили культуру по мутности оптического стандарта ГИСК им. Л.А. Тарасевича 10 ед., затем разведения до 10³, 10², 10¹ м. к./мл из контрольной и опытной пробирок. Проводили высев на питательный агар Хоттингера. Культивирование проводили при 28-30^oC. Учет образования колоний осуществляли через 24-60 ч.

Пример 2. Осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что на опытную культуру воздействовали электрическим полем мощностью 1,2 · 10⁸ Вт/м³ в течение 2 с.

Пример 3. Осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что на опытную культуру воздействовали электрическим полем мощностью 1 · 10⁸ Вт/м³ в течение 2 с двукратно.

Пример 4. Осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что на опытную культуру оказывали тепловое воздействие при 90^oC в течение 30 с с быстрым охлаждением.

Пример 5. Осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что опытную культуру предварительно вводили биопробному животному по способу пат. РФ N 2077891, 1997.

Пример 6. Осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что для культивирования брали вакцинный сибиреязвенный штамм B. anthracis.

Пример 7. Осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что для культивирования брали штамм Е. coli.

В таблице приведены сравнительные данные по учету и образованию колоний при различных способах культивирования.

Как показали результаты экспериментальных исследований, заявляемые режимы стимулирования жизнеспособности микроорганизмов выбраны оптимально, также при снижении напряжения электрического поля и времени обработки стимуляция недостаточна, при повышении же этих параметров выше заявляемых пределов происходит снижение количества образовавшихся колоний. Двукратная обработка в заявляемом режиме также приводила к снижению количества колоний, что объясняется тем, что происходит полное разрушение клеточной структуры.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование в микробиологической практике повысит надежность анализов при культивировании материала после длительного хранения или пребывания в неблагоприятных условиях, а также при контроле штаммов в производстве вакцины.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в бактериологических исследованиях микроорганизмов в объектах внешней среды и восстановлении штаммов, частично утративших свою жизнеспособность. Суспензию исследуемого материала в электролите однократно обрабатывают электрическим полем мощностью (1,0 - 1,2) · 10⁸ Вт/м³ в течение 2 - 3 с. Затем опытную культуру высевают на плотную питательную среду, содержащую стимуляторы и в случае необходимости ингибиторы роста. Инкубируют с последующим учетом образования колоний. Способ обеспечивает повышение роста микроорганизмов. 1 табл.

Способ культивирования микроорганизмов для микробиологических исследований, включающий посев исследуемого материала на плотную питательную среду, содержащую стимулятор роста и в случае необходимости ингибитор роста посторонней микрофлоры, выращивание культуры с последующим учетом образования колоний, отличающийся тем, что предварительно готовят суспензию исследуемого материала в электролите и обрабатывают ее электрическим полем мощностью (1,0 - 1,2) · 10⁸ Вт/м³ в течение 2 - 3 с.