СПОСОБ УСТРАНЕНИЯ ПИРОГЕННОСТИ ПИРОГЕНАЛА ПРИ СОХРАНЕНИИ ЕГО ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ Российский патент 2002 года по МПК A61K31/739 A61K35/66 

Изобретение относится к фармации, конкретно к способам получения иммуностимуляторов на основе природных полисахаридов, и может найти применение при создании соответствующих лекарственных композиций.

Пирогенал представляет собой комплексный препарат липополисахаридов и полисахаридов, выделенных из бактерии Pseudomomas aeruginosa и некоторых других микроорганизмов (М.Д. Машковский. "Лекарственные средства", часть 2, стр. 174-175, М. : Медицина, 1988 г.). Препарат применяют в хирургии при спаечной болезни, послеожоговых келоидных рубцах и контрактурах; в урологии - для лечения стриктур уретры и мочеточников, хронических простатитов и уретритов; в гинекологии - при воспалениях придатков матки; в венерологии - в качестве неспецифического иммуностимулятора в комплексной терапии сифилиса; в офтальмологии - для лечения увеитов, иридоциклитов, герпесвирусной инфекции глаз, вирусных кератитов и конъюнктивитов; в дерматологии - при псориазе, стрептодермии, нейродермитах; в косметологии - для заживления крупных дефектов кожи без образования грубого рубца; в аллергологии - в терапии бронхиальной астмы.

Введение пирогенала (внутримышечно) сопровождается повышением температуры (отсюда и название: "пирос" - по-гречески "огонь, жар", "геннао" - "порождаю"). Обычно вводимую дозу подбирают так, чтобы температура тела не повышалась более чем до 37,5-38^oС; в ряде случаев, однако отмечаются потрясающий озноб и лихорадка (до 39,5^oС) с головной болью и болями в пояснице.

Показано, что пирогенал не только стимулирует эмиссию противовоспалительных монокинов: интерлейкинов-1 и -6, фактора некроза опухолей и других, но и усиливает фагоцитоз, ускоряет образование антител, интерферона, - иными словами, проявляет иммуностимулирующую активность (см. выше относительно его использования в терапии сифилиса). Наличие побочных эффектов (вплоть до рвоты) серьезно ограничивает медицинское применение пирогенала в качестве иммуностимулятора и побуждает искать пути устранения токсического (пирогенного) действия пирогенала.

При мягком кислотном гидролизе пирогенала [Angewandte Chemie (Intl. Ed. In Eng.), 1954, 66, стр. 404-417] или при обработке его катионогенным полипептидом полимиксином В (Immunochemistry, 1976, 13, стр. 813-818) происходит отщепление липоидного компонента (так называемого липида А), ответственного за токсичность пирогенала в целом (D.C. Morrison, "Bacterial Endotoxins..." - in: Reviews of Infect. Diseases. - 1983, том 5, Дополнение 4, стp. S733-S747).

Целью изобретения является создание способа устранения у пирогенала его пирогенности при сохранении его иммуностимулирущей активности, - способа, который не требовал бы применения агрессивных или дорогостоящих и редких химических реактитов и допускал бы точное и легкое управление процессом.

Поставленная цель достигнута благодаря тому, что в способе устранения пирогенности пирогенала при сохранении его иммуностимулирующей активности, предусматривающем физико-химическое воздействие на пирогенал, находящийся в водном растворе, указанное воздействие осуществляют в виде гамма-облучения при мощности дозы 35-45 или 115-125 кГр, при этом концентрацию исходного липополисахарида берут равной 10-100 мкг/мл, а в качестве источника гамма-излучения используют кобальт-60. В предпочтительном варианте облучению подвергают официнальный (фармакопейный) раствор пирогенала концентрации 100 мкг/мл при мощности дозы 40 или 120 кГр.

Эффекты воздействия лучистой энергии на полисахариды, находящиеся вне "материнской" клетки и, следовательно, не защищенные клеточными органеллами, в литературе описаны: так, гамма-облучение водных растворов полисахаридов из S. Typhi в дозе 1 Мрад вызывает значительную деструкцию ("Радиобиология", 1970, 10, стр. 468). Известно, далее, что уменьшение иммуногенности форменных элементов крови может быть достигнуто при облучении УФ-светом в дозе 120-13500 Дж/м² (заявка ЕПВ 229830), а в процессе облучения клеток млекопитающих УФ-светом (280-320 нм, 10-200 Дж/м²) образуются гликопротеины, проявляющие иммуносупрессорную (подавляющие иммунитет) активность (заявка ЕПВ 489732). С другой стороны, инактивация виpуcoв-кoнтaминантoв человеческого лейкоцитарного интерферона обеспечивается согласно патенту Российской Федерации 2080877 гамма-облучением в дозе 15-25 кГр.

Нами было обнаружено, что облучение пирогенала в водном растворе гамма-радиацией в строго определенных дозах сопровождается утратой пирогеналом своей пирогенности при сохранении иммуностимулирующей активности, что, по-видимому, обусловлено отщеплением липида А или, вероятнее всего, и других фрагментов молекулы пирогенала (в пользу последнего предположения свидетельствует дискретный характер радиационного воздействия: либо 35-45, либо 115-125 кГр, при этом промежуточные дозы подобного эффекта не вызывают). Косвенно сказанное подтверждается сдвигом профиля иммуностимулирующей активности в сторону активации В-лимфоцитов после гамма-облучения пирогенала дозой 120 кГр.

Детально изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Официнальный раствор пирогенала, выпускаемый в ампулах по 1 мл и имеющий концентрацию 100 мкг/мл, подвергают гамма-облучению от источника кобальт-60 в дозе 40 кГр.

Пример 2. Поступают аналогично примеру 1 с тем отличием, что дозу увеличивают до 120 кГр.

Пример 3. На белых беспородных мышах-самцах с массой 18-20 г производили оценку влияния раствора, полученного согласно примеру 1, на гуморальный иммунный ответ к эритроцитам барана, о чем судили по титру гемагглютининов в сыворотке крови и по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке животных, иммунизированных эритроцитами барана. Титр гемагглютининов и число АОК определяли на 6-е сутки после иммунизации животных оптимальной дозой эритроцитов барана, т.е. 5•10⁸ эритроцитов на мышь, внутрибрюшинно. Число АОК определяли слайд-методом Каннингэма. Раствор вводили внутрибрюшинно двукратно, с интервалом в два дня, в дозе 5 и 10 мкг/мышь, первое введение - спустя сутки после иммунизации. Среднее значение (из 12) log₂ титра гемагглютининов составило 8,0, а число АОК на 106 спленоцитов равнялось 400, что соответствовало величинам для самого пирогенала.

Пример 4. На кроликах породы шиншилла осуществляли оценку пирогенной реакции на введение раствора, полученного согласно примеру 2: на трех животных - в дозе 50 мкг/кг, а еще три кролика служили контролем (пирогенал, доза 50 мкг/кг). Ректальную термометрию производили с помощью электронного термометра до введения раствора, спустя 2, 6 и 8 часов после введения. В случае раствора облученного пирогенала соответствующие величины составили 38,4±0,2^o/39,4±0,4^o/38,7±0,8^o/38,4±0,8^o, а в случае пирогенала - 38,7±0,7^o/40,3±0,5^o/39,6±0,2^o/38,4±0,2^o.

Изобретение относится к способам получения иммуностимуляторов, лишенных таких побочных эффектов, как пирогенность. Согласно изобретению водный раствор пирогенала, взятого в концентрации 10-100 мкг/мл, подвергают гамма-облучению в дозе 40 или 120 кГр (дискретные значения). Технический результат: способ обеспечивает устранение пирогенности пирогенала. 4 з.п. ф-лы.

1. Способ устранения пирогенности пирогенала при сохранении иммуностимулирующей активности, предусматривающий физико-химическое воздействие на пирогенал, находящийся в водном растворе, отличающийся тем, что указанное воздействие осуществляют в виде гамма-облучения в дозе 35-45 или 115-125 кГр. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что начальную концентрацию пирогенала выбирают равной 10-100 мкг/мл. 3. Способ по любому из пп. 1 и 2, отличающийся тем, что гамма-облучение осуществляют в дозе 40 или 120 кГр. 4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что гамма-облучению подвергают официнальный раствор пирогенала в ампуле. 5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что в качестве источника гамма-излучения используют кобальт-60.