Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть).
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии и касается способа оценки повреждения ДНК. Представленный способ включает получение контрольной двухцепочечной ДНК-матрицы с первой и второй комплементарными цепями, каждая из которых имеет специфический для цепи праймерный сайт, и праймерные сайты разделены, по меньшей мере, 5000 парами оснований, соединение первой и второй комплементарной цепи с праймерами, осуществление количественной амплификации с использованием rTth-полимеразы и Трицин-буфера, повторение указанных выше стадий с испытываемой двухцепочечной ДНК-матрицей, подвергнутой воздействиям ДНК-повреждающих условий, оценку повреждения ДНК путем определения снижения степени амплификации для испытываемой ДНК-матрицы по отношению к контрольной ДНК-матрице. Способ по настоящему изобретению позволяет производить анализ ДНК длиной более 5000 п. о., а также производить контроль генетических повреждений, которые произошли вследствие самоиндуцированного воздействия генотоксинов. 4 с. и 2 з.п. ф-лы, 4 табл., 28 ил.
1. Способ оценки повреждения ДНК в испытываемой двухцепочечной ДНК-матрице, включающий следующие стадии: получают контрольную двухцепочечную ДНК-матрицу в количестве 1-30 нг с первой и второй комплементарными цепями ДНК, причем каждая из первой и второй комплементарной цепей ДНК имеет специфический для цепи праймерный сайт; соединяют первую и вторую комплементарные цепи в смеси с праймерами к специфическому для цепи праймерному сайту на каждой комплементарной цепи; осуществляют в смеси количественную амплификацию ДНК; повторяют указанные выше стадии с испытываемой двухцепочечной ДНК-матрицей в количестве 1-30 нг, подвергнутой воздействиям ДНК-повреждающих или потенциально ДНК-повреждающих условий; оценивают повреждения ДНК путем определения снижения степени амплификации для испытываемой ДНК-матрицы по отношению к контрольной ДНК-матрице, отличающийся тем, что амплификацию осуществляют с использованием rTth-полимеразы и Трицин-буфера, и праймерные сайты разделяются, по меньшей мере, 5000 парами оснований. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что двухцепочечная ДНК-матрица является ген-специфической двухцепочечной ДНК-матрицей. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество контрольной и испытываемой ДНК одинаковое и составляет от около 5 до 15 нг ДНК. 4. Способ диагностирования эффективности противоопухолевой терапии у пациента, включающий следующие стадии: получают контрольную двухцепочечную ДНК-матрицу в количестве 1-30 нг от пациента до лечения химиотерапевтическими агентами, причем указанная контрольная ДНК-матрица имеет первую и вторую комплементарную цепи ДНК, и каждая комплементарная цепь ДНК имеет специфический для цепи праймерный сайт; соединяют первую и вторую комплементарные цепи ДНК в смеси с праймерами к специфическому для цепи праймерному сайту на каждой комплементарной цепи ДНК; осуществляют в смеси количественную амплификацию ДНК, повторяют указанные выше стадии с испытываемой двухцепочечной ДНК-матрицей, полученной от пациента после или во время указанной терапии, причем пациент подвергался воздействию ДНК-повреждающих или потенциально ДНК-повреждающих условий; оценивают повреждение ДНК в контрольной и испытываемой ДНК-матрице путем определения более низкой степени амплификации для испытываемой ДНК-матрицы по отношению к контрольной ДНК-матрице, причем эффективность указанной терапии прямо пропорциональна повреждению ДНК, выявленной в испытываемой ДНК-матрице, отличающийся тем, что указанную амплификацию ДНК осуществляют с использованием rTth-полимеразы и Трицин-буфера, и праймерные сайты разделяются по меньшей мере 5000 парами оснований. 5. Способ оценки повреждения ДНК, включающий следующие стадии: получают контрольную двухцепочечную ДНК-матрицу с первой и второй комплементарными цепями ДНК, причем каждая из первой и второй комплементарной цепей имеет специфический для цепи праймерный сайт и имеет такие повреждения, как 8-оксидезоксигуанозин или формамидопиримидин; обрабатывают часть контрольной ДНК-матрицы гликозилазой/эндонуклеазой или формамидопиримидин-ДНК-гликозилазой для превращения повреждения ДНК в разрыв цепи, в результате чего образуется испытываемая двухцепочечная ДНК-матрица; соединяют по отдельности первую и вторую комплементарные цепи контрольной и испытываемой ДНК-матрицы в количестве 1-30 нг с праймерами к специфическим для цепей праймерным сайтам на каждой из комплементарных цепей; осуществляют количественную амплификацию ДНК на контрольной и испытываемой ДНК-матрице; оценивают повреждение ДНК путем определения снижения степени амплификации ДНК испытываемой ДНК-матрицы по отношению к контрольной ДНК-матрице, отличающийся тем, что амплификацию ДНК осуществляют с использованием rTth-полимеразы и Трицин-буфера, и праймерные сайты разделяются по меньшей мере 5000 парами оснований. 6. Способ оценки повреждения ДНК, индуцированного цисплатином, включающий следующие стадии: получают испытываемый образец от пациента, подвергаемого цисплатиновой терапии, причем указанный испытываемый образец содержит двухцепочечную ДНК-матрицу с первой и второй комплементарными цепями ДНК, причем каждая из первой и второй комплементарной цепей имеет специфический для цепи праймерный сайт; обрабатывают часть испытываемого образца количеством цианид-иона, вытесняющего цисплатиновые аддукты из ДНК, с образованием второй двухцепочечной ДНК-матрицы, включающей контрольный образец; соединяют по отдельности первую и вторую комплементарные цепи ДНК в количестве 1-30 нг испытываемого и контрольного образцов с праймерами для специфического для цепи праймерного сайта на каждой из комплементарных цепей; осуществляют количественную амплификацию ДНК на испытываемом и контрольном образцах, при этом пониженная степень амплификации испытываемого образца по отношению к контрольному образцу является мерой индуцированного цисплатином повреждения ДНК, отличающийся тем, что амплификацию осуществляют с использованием rTth-полимеразы и Трицин-буфера, и праймерные сайты разделяются по меньшей мере 5000 парами оснований.
