ПИТАТЕЛЬНАЯ ДВУХФАЗНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/10 C12Q1/08 C12R1/90 

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и паразитологии, и может быть использовано для культивирования микроорганизмов, таких как, например, криптоспоридий, трихомонад и пр. в искусственных питательных средах, не содержащих клеток хозяина.

Культивирование микроорганизмов in vitro имеет большое значение для изучения новых противомикробных препаратов, расшифровки эволюционной биологии и жизненного цикла микроорганизмов, оценки их жизнеспособности при эпидемиологических исследованиях. Преимущества способов культивирования микроорганизмов в среде, не содержащей клеток хозяина, животных или человека, заключаются в гораздо меньших материальных и технических затратах. Такие среды позволяют получить чистые антигены отдельных стадий развития микроба без примесей белков клеток хозяина для создания вакцин, бесклеточные среды упрощают исследование in vitro потенциальных средств противомикробного действия.

Некоторые микроорганизмы с трудом удается выращивать на твердых или жидких питательных средах, но они гораздо более активно растут и размножаются в двухфазных питательных средах, состоящих из комбинации твердой и жидкой фаз. Возможным объяснением может быть то, что подобные двухфазные питательные среды создают условия роста и размножения, приближенные к естественным, когда часть стадий жизненного цикла микроба требует твердой питательной среды, а другие стадии жизненного цикла проходят в жидкой питательной среде. Это, в частности, свойственно микроорганизмам, которые частично размножаются в клетках слизистых оболочек, а частично - на поверхности слизистой в просвете органа, например в кишечнике. При этом состав компонентов жидкой и твердой фазы питательной среды определяется особенностями биологии конкретного микроорганизма. Существуют такие питательные двухфазные среды, в которых в качестве твердой фазы используют коагулированную сыворотку, например, крупного рогатого скота, лошади и пр.

Проведенным поиском по научно-медицинской и патентной литературе найдены различные питательные двухфазные среды для культивирования микроорганизмов с использованием в качестве твердой фазы коагулированной сыворотки.

Так, патентом Российской Федерации №2272834 (2006 г., БИПМ №9) защищена питательная двухфазная среда для выделения одноклеточных микроорганизмов - трихомонад. Жидкая фаза содержит питательную среду 199 с антибиотиками. Твердая фаза представлена коагулированной сывороткой крупного рогатого скота или лошади. Недостатком такой среды является то, что твердая фаза нестабильна и в процессе культивирования возможен переход ее частиц в жидкую фазу.

Наиболее близким техническим решением, принятым нами в качестве прототипа, является двухфазная питательная среда, использованная авторами из Австралии для культивирования микроорганизмов, а именно криптоспоридий, которые с трудом удается выращивать в искусственных условиях и в отсутствии клеток хозяина (Hijjawi NS, Meloni BP, Ng'anzo M, Ryan UM, Olson ME, Сох РТ, Monis PT, Thompson RC. Complete development of Cryptosporidium parvum in host cell-free culture. Int J Parasitol. 2004 Vol.34, No. 7, p.769-777.). Этими авторами было показано, что наиболее активный рост и размножение криптоспоридий наблюдались в двухфазной питательной среде, которая включала жидкую и твердую фазы. Жидкая фаза питательной среды была представлена средой RPMI-1640 с добавлением к ней дополнительных компонентов. Твердая фаза состояла из коагулированной сыворотки новорожденного теленка.

Недостатком прототипа является недостаточная стабильность твердой фазы двухфазной среды, за счет чего в процессе культивирования возможен переход фрагментов твердой фазы в жидкую фазу. Это затрудняет, а в ряде случаев делает невозможным оценку результатов динамики роста культуры, т.е. результатов культивирования конкретных микроорганизмов, и таким образом снижает достоверность результатов исследования.

Целью предлагаемого изобретения является стабилизация твердой фазы двухфазной среды и предупреждение перехода фрагментов твердой фазы питательной среды в жидкую фазу.

Поставленная цель достигается тем, что содержащая коагулированную сыворотку твердая фаза двухфазной среды для культивирования микроорганизмов дополнительно содержит агарозу при соотношении компонентов твердой фазы: 1 г сухой агарозы на каждые 50 мл жидкой сыворотки.

Подробное описание приготовления питательной двухфазной среды для культивирования микроорганизмов представлено ниже.

Для приготовления твердой фазы берут стерильную сыворотку новорожденного теленка (например, Sigma-Aldrich, Cat. No. N4637) в объеме 10 мл и помещают в стерильную камеру для культивирования объемом 50 мл с площадью основания 25 см² (например, BD Falcon Cell Culture Flask, BD Bioscience, USA. Cat. No. 353014). К сыворотке в стерильных условиях добавляют сухую агарозу (например, Sigma-Aldrich, Cat. No. A9539) в количестве 0,2 г, и перемешивают путем многократного пипетирования до получение однородной смеси. После перемешивания смесь сыворотки новорожденного теленка и агарозы коагулируют при 70-80°С (например, в термостате LOIP LT-108a, ТЖ-ТС-01/8-100) в течение 45 минут. После коагуляции смесь сыворотки с агарозой охлаждают до комнатной температуры.

Состав жидкой фазы питательной среды определяют исходя из биологических особенностей конкретного культивируемого микроорганизма. Жидкую фазу в объеме 40 мл вносят в камеру для культивирования, содержащую описанную выше твердую фазу, т.е. коагулированную смесь сыворотки с агарозой.

В результате полимеризации агарозы в процессе коагуляции сыворотки агароза образует инертную матрицу, выполняющую роль арматуры для коагулированной сыворотки и способствует стабилизации последней, что препятствует переходу фрагментов коагулированной сыворотки в жидкую фазу двухфазной питательной среды.

Практическая реализуемость использования предлагаемой питательной двухфазной среды для культивирования микроорганизмов, в частном случае - криптоспоридий, подтверждается следующим примером.

Пример

Для приготовления твердой фазы заявляемой питательной двухфазной среды брали стерильную сыворотку новорожденного теленка (Sigma-Aldrich, Cat. No. N4637) в количестве 10 мл и внесли в стерильную камеру для культивирования объемом 50 мл с площадью основания 25 см² (BD Falcon Cell Culture Flask, BD Bioscience, USA. Cat. No. 353014). К сыворотке в стерильных условиях добавили сухую агарозу (Sigma-Aldrich, Cat. No. А9539) в весовом количестве 0,2 г и перемешали путем повторного пипетирования до получения однородной смеси. Смесь сыворотки новорожденного теленка и агарозы в указанной выше пропорции подвергали коагуляции при 70-80°С в течение 45 минут в термостате LOIP LT-108a ТЖ-ТС-01/8-100. После коагуляции смеси сыворотки с агарозой ее охладили до комнатной температуры.

Для приготовления жидкой фазы двухфазной среды для культивирования Cryptosporidium parvum брали среду RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Cat. No. R8758) в объеме 80 мл и в стерильных условиях вносили ее в стерильный флакон емкостью 150 мл. К указанному объему среды добавляли 0,003 г L-глютамина (Sigma-Aldrich, Cat. No. G3126), 0,3 г бикарбоната натрия (Sigma-Aldrich, Cat. No. S5761), 0,02 г бычьей желчи (Sigma-Aldrich, Cat. No. B3883), 0,1 г глюкозы (Sigma-Aldrich, Cat. No. 49158), 25 мкг фолиевой кислоты (Sigma-Aldrich, Cat. No. F7876), 100 мкг 4-аминобензойной кислоты (Sigma-Aldrich, Cat. No. 06930), 50 мкг пантотената кальция (Sigma-Aldrich, Cat. No. C8731), 875 мкг аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich, Cat. No. A5960), 1% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich, Cat. No. F2442), 0,36 г HEPES (Sigma-Aldrich, Cat. No. H3375), 10000 ЕД калиевой соли пенициллина G (Sigma-Aldrich, Cat. No. P7794), 0,01 г стрептомицина сульфата (Sigma-Aldrich, Cat. No. S6501). Конечный объем среды доводили до 100 мл путем добавления необходимого объема среды RPMI-1640. Показатель рН жидкой фазы доводили до 7,4 с помощью 0,1 Н раствора NaOH (Sigma-Aldrich, Cat. No. S8045). Приготовленную среду стерилизовали путем фильтрования через целлюлозно-ацетатный фильтр с размером пор 0,20 мкм (Cole-Parmer, Cat. No. RK-06731-20) и собирали в стерильный флакон емкостью 150 мл.

Приготовленная таким образом жидкая фаза среды в объеме 40 мл была внесена в камеру для культивирования с описанной выше твердой фазой.

В стерильных условиях в камеру для культивирования, содержащую двухфазную питательную среду указанного выше состава, был произведен посев исследуемого материала, представляющего собой ооцисты Crypto-sporidium parvum в количестве 1000000. Ооцисты были выделены из испражнений больного и прошли предварительные этапы очистки и обеззараживания (Arrowood MJ.. In vitro cultivation of Cryptosporidium species. Clinical Microbiology Reviews. 2002, Vol.15, No. 3, p.390-400.).

Инкубацию посевов осуществляли при 37°С в атмосфере с содержанием 5% СO₂ в термостате ESPEC N2-O2-CO2 Culture Box. На 1-й, 3-й, 4-й, 8-й, 9-й, 17-й, 20-й и 48-й день инкубации отбирали по 10 мл жидкой фазы питательной среды. Вместо отобранных из камеры для культивирования 10 мл жидкой фазы, в камеру каждый раз вносили 10 мл стерильной свежеприготовленной жидкой фазы питательной среды.

Отобранные для исследования культуры 10 мл жидкой фазы питательной среды каждый раз помещали в стерильные пластиковые пробирки емкостью 15 мл и центрифугировали при ускорении 1000 g в течение 10 мин. После центрифугирования удаляли надосадочную жидкость. В осадке с помощью микроскопа Olympus BX51 исследовали динамику роста и развития культуры криптоспоридий.

За время наблюдения за культурой в указанные выше сроки не было зафиксировано ни одного случая перехода компонентов твердой фазы питательной среды в жидкую фазу.

Таким образом, приготовленная предлагаемым способом питательная двухфазная среда была стабильной, что позволило с высокой степенью достоверности выполнить оценку стадий роста и развития культуры криптоспоридий.

С помощью предлагаемой питательной двухфазной среды для культивирования микроорганизмов были исследованы 48 культур криптоспоридий. Ни в одном случае не было отмечено перехода фрагментов твердой фазы в жидкую фазу, что позволило на всех этапах исследования и во всех 48 случаях получить достоверные результаты оценки роста и развития культуры.

При использовании прототипа в 7 из 12 случаев культивирования (58,3%) наблюдался переход фрагментов твердой фазы питательной среды в жидкую фазу, начиная с 17-го дня наблюдения. В результате этого после центрифугирования отобранных для исследования 10 мл жидкой части питательной среды на дне пробирки образовывался осадок из фрагментов твердой фазы питательной среды, препятствующий микроскопическому изучению культуры и оценке динамики ее роста и развития.

Таким образом, по сравнению с прототипом предлагаемая питательная двухфазная среда стабильна, фрагменты твердой фазы не переходят в жидкую, что позволяет существенно повысить достоверность оценки результатов культивирования микроорганизмов.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования микроорганизмов в искусственных питательных двухфазных средах. Питательная среда содержит жидкую фазу, состав жидкой фазы определяется биологическими особенностями конкретного микроорганизма, и твердую фазу. Твердая фаза содержит коагулированную сыворотку и агарозу в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить достоверность оценки результатов роста и развития культуры микроорганизмов.

Питательная двухфазная среда для культивирования микроорганизмов, содержащая жидкую фазу, состав которой определяется биологическими особенностями конкретного микроорганизма, и твердую фазу из коагулированной сыворотки, отличающаяся тем, что твердая фаза дополнительно содержит агарозу при следующем соотношении компонентов твердой фазы: 1 г сухой агарозы на каждые 50 мл жидкой сыворотки.