МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИВАЛЕНТНАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА И ДИАРЕЙ, ВЫЗВАННЫХ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫМИ БАКТЕРИЯМИ Российский патент 2006 года по МПК A61K39/10 A61K39/116 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам конструирования вакцины и ее применения для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями Е. coli, V. cholera и другими.

Уровень техники

Для профилактики бруцеллеза в настоящее время используются живые вакцины на основе аттенуированных штаммов Brucella abortus 82, 82рп и 75/79 в России, Brucella abortus RB51 и S19 в США [1-4]. Живые бактериальные вакцины являются эффективным инструментом для создания защитного иммунитета против внутриклеточных паразитов, но в случае с бруцеллами такие вакцины не обеспечивают достаточного уровня защиты. Все перечисленные вакцины не обеспечивают 100% защиту животных от бруцеллеза. Кроме того, они не безопасны для человека и при вакцинации могут провоцировать развитие инфекционного процесса. Практическое использование этих вакцин показало, что вакцинация во многих случаях приводит к развитию вялотекущей бруцеллезной инфекции с разнообразными осложнениями аллергенного характера.

Известна также вакцина на основе инактивированных нагреванием при 80°С клеток бруцелл штамма 45/20 и разрушенных ультразвуком [4]. Антигенная субстанция осаждается 10% трихлоруксусной кислотой и лиофильно высушивается. Данная вакцина требует двукратного введения и обладает высокореактогенными свойствами.

Другим известным препаратом является вакцина на основе белково-полисахаридного комплекса, выделенного химическим путем из клеток бруцелл [5]. Основным недостатком этого препарата является неизвестный состав и отсутствие возможности введения стандартизации различных партий.

Для профилактики диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями Е. coli, V. cholera, используется иммунизация животных препаратами, содержащими В-субъединицы термолабильного или холерного токсина.

Настоящее изобретение позволяет решить такие задачи, как высокая стандартизация препарата на основе точного химического состава вакцины, дозируемость и возможность введения различными способами (внутримышечно, подкожно, интраназально и перорально), при этом достигается следующий результат: при двукратном подкожном введении создает напряженный и длительный (не менее одного года) иммунитет у привитых животных, эффективный против экспериментального заражения бруцеллами за счет индукции специфических цитотоксических лимфоцитов [6].

Сущность изобретения

Сущностью изобретения - это молекулярная вакцина для профилактики бруцеллеза на основе белка внешних мембран бруцелл с молекулярным весом и аминокислотной последовательностью

MRTLKSLVIVSAALLPFSATAFAADAIQEQPPVPAPVEVAPQYSWAGGYTGLYLGY GWNKAKTSTVGSIKPDDWKAGAFAGWNFQQDQIVYGVEGDAGYSWAKKSKDGLEVK QGFEGSLGARVGYDLNPVMPYLTAGIAGSQIKLNNGLDDESKFRVGWTAGAGLEAKLT DNILGRVEYRYTQYGNKNYDLAGTTVRNKLDTQDIRVGIGYKF, [1]

конъюгированного с молекулярным носителем, в качестве которого были использованы В-субъединицы термолабильного энтеротоксина Е. coli.

Рекомбинантный белок очищали с помощью аффинной хроматографии. Культуры штаммов E. coli BL21, продуцентов белков, выращивали на L-бульоне с добавлением ампициллина (50 мкг/мл) до OD₆₀₀=0,6-0,8 и индуцировали экспрессию рекомбинантных белков с помощью 1-2 mM изопропил-D-тиогалактопиранозила (ИПТГ). Через три часа после культивирования с индуктором бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 6000 g в течение 30 минут и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора (3 раза по 30 секунд с минутным интервалом при мощности 150 Вт) в присутствии ингибитора протеаз PMSF. После удаления центрифугированием при 10000 g в течение 30 минут клеточного дебриса супернатант наносили на колонку сефарозой, к которой ковалентно были присоединены антитела против В-субъединиц термолабильного токсина. Связанный белок элюировали 3М гуанидинхлорида. Очищенный препарат рекомбинантных белков обессоливали на колонке с биогелем Р6, уравновешенным Na-фосфатным буферным раствором рН 7,2 и хранили при температуре 4°С.

Пример. Профилактическую эффективность разработанного препарата изучали на мышиной модели бруцеллеза. В качестве модели экспериментального бруцеллеза использовали мышей линии СВА, инфицированных дозой в 10⁴ КОЕ (колонеобразующих единиц) штамма Brucella abortus SI9. Через 7-10 дней высевы из селезенки демонстрировали инфицированность на уровне 10^5,5-6 КОЕ. Животным (в каждой группе по 10) вводили препарат рекомбинантных белков в дозах от 100 нг до 5 мкг подкожно в объеме 0,1 мл. Через месяц проводили повторную иммунизацию. Через 6 месяцев после последней иммунизации животным внутрибрюшинно в дозе 10⁴ КОЕ вводили культуру Brucella abortus SI9, выращенную на чашках с эритрит-агаром, в объеме 0,5 мл. Вскрытие проводили на 7-10 сутки после заражения. Селезенку взвешивали и помещали в стерильную ступку, тщательно растирали пестиком до получения однородной массы. В ступку с гомогенатом вносили 5 мл стерильного Na-фосфатного буфера с 0,2% Tween-80, дополнительно гомогенизировали и титровали шагом 1:10. Из каждого разведения производили посев в объеме 0,1 мл на чашки с эритрит-агаром с добавлением полимиксина. Предварительный учет результатов проводили через 5 суток, окончательный учет - через 10 суток.

Таблица 1.
Инфицированность селезенки бруцеллами у животных, иммунизированных подкожно различными дозами препарата.ПрепаратВысеваемость (log КОЕ) при различных инфицирующих дозах10² КОЕ10⁴ KOEКонтроль 1 (физиологический р-р)-3,67±0,525,94±0,81Контроль 2 (A^201-258-BLT, 53,34±0,655,88±0,87omp25-A^201-258-BLT, 100 нг2,11±0,534,15±0,75omp25-A^201-258-BLT, 500 нг02,81±0,33omp25-A^201-258-BLT, 1 мкг02,03±0,41omp25-A^201-258-BLT, 5 мкг01,48±0,45

Таблица 2.
Инфицированность селезенки бруцеллами у животных, иммунизированных перорально различными дозами препарата.ПрепаратВысеваемость (log КОЕ) при различных инфицирующих дозах10² KOE10⁴ KOEКонтроль 1 (физиологический р-р)3,81±0,616,43±0,84Контроль 2 (A^201-258-BLT, 53,74±0,596,80±0,89omp25-A^201-258-BLT, 100 нг2,93±0,675,75±0,63omp25-A^201-258-BLT, 500 нг1,96±0,734,81±0,57omp25-A^201-258-BLT, 1 мкг0,98±0,762,99±0,48omp25-A^201-258-BLT, 5 мкг01,87±0,42

Таблица 3.
Титр антител против В-субъединиц термолабильного энтертоксина у животных, иммунизированных подкожно и перорально различными дозами препарата.ПрепаратТитр антител против В-субъединиц у животныхподкожнопероральКонтроль 1 (физиологический р-р)00Контроль 2 (A^201-258-BLT, 5 мкг)1/12801/640omp25-A^201-258-BLT, 100 нг1/1601/160omp25-A^201-258-BLT, 500 нг1/3201/320omp25-A^201-258-BLT, 1 мкг1/12801/640omp25-A^201-258-BLT, 5 мкг1/12801/640

Таким образом, разработанная молекулярная вакцина индуцирует специфический и длительный иммунитет, эффективно защищающий от инфицирования высокими дозами бруцелл: двукратное введение молекулярной вакцины подкожно в дозе от 500 нг до 5 мкг эффективно и статистически достоверно снижает инфицированность более чем в 1000 раз при инфицирующей дозе 10⁴ КОЕ и демонстрирует отсутствие высеваемости при инфицирующей дозе 10² КОЕ, при пероральном введении отсутствие высеваемости бруцелл наблюдается только при высокой дозе в 5 мкг и значительное более чем в 600 раз снижение инфицированности при высокой дозе инфицирования. При обоих способах вакцинации рекомбинантными препаратами титр антител против В-субъединицы термолабильного энтеротоксина достигал тех же значений, что и против нативных В-субъединиц (1/1280 при дозе в 5 мкг).

Источники информации

1. Сухая живая вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма №19, ГОСТ 1859-73.

2. Патент Франции №2479000, кл. F 61 K 39/10, 1983.

3. Авторское свидетельство СССР №467933, кл. F 61 K 39/08, опубл. 1975.

4. Ветеринарные препараты. Справочник /Сост. Ю.Ф.Борисевич, Л.В.Кириллов./ Под ред. Д.Ф.Осидзе. М.: Колос, 1981, с.178-180.

5. Изучение иммуногенной активности искусственных бруцеллезных антигенов. /Петров Р.В. и др./ - ЖМЭИ №7, 1988, с.39-42.

6. Induction of specific cytotoxic lymphocytes in mice vaccinated with Brucella abortus RB51. /He Y, Vemulapalli R, Zeytun A, Schurig GG./ Infect Immun. 2001. 69(9), p.5502-5508.

7. Nucleotide sequence and expression of the gene encoding the major 25-kilodalton outer membrane protein of Brucella ovis: Evidence for antigenic shift, compared with other Brucella species, due to a deletion in the gene /Cloeckaert A, Verger JM, Grayon М, Zygmunt MS, Grepinet O./ Infect Immun. 1996 Jun; 64(6): 2047-55.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Предложена молекулярная бивалентная вакцина для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями. Вакцина содержит белок внешних мембран бруцелл, конъюгированный с молекулярным носителем, в качестве которого используются В-субъединицы термолабильного энтеротоксина E. coli. Предложенная вакцина индуцирует специфический и длительный иммунитет, эффективно защищающий от инфицирования высокими дозами бруцелл и энтеропатогенных E. coli и V. cholera. Изобретение может быть использовано в ветеринарии. 3 табл.

Молекулярная бивалентная вакцина для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями (E. Coli, V. Cholera и другие), отличающаяся тем, что в качестве специфического начала используется белок внешних мембран бруцелл с молекулярной массой 25 kDa и аминокислотной последовательностью

MRTLKSLVIVSAALLPFSATAFAADAIQEQPPVPAPVEVAPQYSWAGGYTGLYLGYGWN KAKTSTVGSIKPDDWKAGAFAGWNFQQDQIVYGVEGDAGYSWAKKSKDGLEVKQGFEGS LGARVGYDLNPVMPYLTAGIAGSQIKLNNGLDDESKFRVGWTAGAGLEAKLTDNILGRVE YRYTQYGNKNYDLAGTTVRNKLDTQDIRVGIGYKF,

конъюгированный с молекулярным носителем, в качестве которого используются В-субъединицы термолабильного энтеротоксина Е. coli.