Способ идентификации VIвRIо аLвеNSIS Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности, к лабораторной диагностике Vibrio alben- sis (синоним V.phosphorescens).

Светящиеся вибрионы вызывают диа- рейные заболевания и обнаруживаются не только у больных людей, но и в объектах окружающей среды. Методы диагностики Vibrio albensis разработаны недостаточно. Серологическое типиро- вание не используется из-за отсутствия коммерческих сывороток.

Известен способ идентификации светящихся вибриоко-в, принцип которого основан на том, что при совместном выращивании с испытуемой на свечение культурой в пробирке с пептонной водой индикаторный штамм V.albensis индуцирует свечение испытуемого штамма.

Однако этот способ основан на выявлении индуцированной биолюминесценции, являющейся непостоянным признаком. Свечение индикатора-индуктора зависит от качества и состава питательной среды, сроков хранения, температуры и времени культивирования, а также симбиотических реакций или реакций ингибиции в смешанных культурах. Отсутствие критериев отбора штамма-индуктора, подбор определенных концентраций культур в смесях, индивидуальные особенности адаптации зрения и восприятия интенсивности свечения затрудняют идентификацию светящихся вибрионов. Применение известного способа создает сложности при исследовании большого количества штаммов, утративших биолюминесценцию в процессе длительного хранения.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Это достигается тем, что к клеточной суспензии фагочувствительного индикаторного штамма светящихся вибриосл

С

xj

VI

оо

00 00

«on 3dсева от идентифицируемый штамм V.a bcnsis и через 20-2 часа инкубации при 37° реакционную смесь культур прогревают при 55-57°. Прогретуюg

взвесь инактивированных клеток наносят на газон индикаторного штамма Е виде дорожки. Учет результатов проводят по появлению зоны лизиса фагом спустя 20-24 часа выращивания при 37.° JQ Продукцию Фага выявляют при посеве испытуемых штаммоз с индикаторной .культурой V.albonsis 1193C, депонированной в Музее микроорганизмов института Микроб по номером КМ-41

15

(1193С). На газоне штамма КМ-41 (1193С) фаги V.albensis формируют прозрачные и мутные зоны лизиса. В качестве индикаторного штамма может быть использована любая нелизогенная фагочугзствительная культура V.albensis. Тест-штамм X .albensis 1193С чз- ляется универсально фагочувствитель- ным, поэтому был выбран нами из 11- фагочувствителыных штаммов. Штамм КМ-41 (1193С) по большинству морфологических и физиологических характеристик соответствует микроорганизмам вида Vibrio albensis.

Культурально-морфологчческие приз-gQ но чи.

В мазках из агаровых, и бульонных культур, окрашенных по Граму, клетки имеют вид грамотрицательных полиморфных палочек.

20

25

род. Штамм устойчив к 50 мкг/мл поли миксиня.

Отношение к гомо- и гетерологичны Фагам: штамм не лизируется диагности ческими фагами, классическим холерны и эльтор.

ХДФ 3 - отр ХДО 4 - отр 5- от

Лизируется фагами, продуцируемыми V.albensis.

Отношение штамма к видовым диаг- ностическим сывороткам: штамм не агглютинируется 0 холерной сывороткой и типоспецифическими сыворотками Ина ба, Огава.

Антигенные свойства штамма: штамм вирулентный для кроликов-сосунков в дозе 1C кл.

Питательные потребности, прототроф (на среде Бхаскарана и Роули растет)

Генетические особенности штамма: является стрептомицинустойчивым Фосфоресцирующим мутантом V.albensis.

Продукт, синтезируемый штаммом: штамм продуцирует фермент люциферазу обеспечивающую в темноте фосфоресцен цию колоний и бульонной культуры.

При посеве в качестве индикаторно го с лизогенными штаммами V.albensis выявляет умеренные фаги.

Активность (продуктивность) штамма: штамм является индикатором для фагов, образуемых лизогенными культу рами. При посеве выращенного в бульо не штамма в слое 0,7% агара по ГраПодвижныё (при выращивании в 0-,3%ция, засеянные в виде дорожки фаги

g

Q

5

Q

0

5

род. Штамм устойчив к 50 мкг/мл поли- миксиня.

Отношение к гомо- и гетерологичным Фагам: штамм не лизируется диагностическими фагами, классическим холерным и эльтор.

ХДФ 3 - отр ХДО 4 - отр 5- отр

Лизируется фагами, продуцируемыми V.albensis.

Отношение штамма к видовым диаг- , ностическим сывороткам: штамм не агглютинируется 0 холерной сывороткой и типоспецифическими сыворотками Ина- ба, Огава.

Антигенные свойства штамма: штамм вирулентный для кроликов-сосунков в дозе 1C кл.

Питательные потребности, прототроф (на среде Бхаскарана и Роули растет).

Генетические особенности штамма: является стрептомицинустойчивым Фосфоресцирующим мутантом V.albensis.

Продукт, синтезируемый штаммом: штамм продуцирует фермент люциферазу, обеспечивающую в темноте фосфоресценцию колоний и бульонной культуры.

При посеве в качестве индикаторного с лизогенными штаммами V.albensis выявляет умеренные фаги.

Активность (продуктивность) штамма: штамм является индикатором для фагов, образуемых лизогенными культурами. При посеве выращенного в бульоне штамма в слое 0,7% агара по Гра

Использование: медицинская микробиология, лабораторная диагностика Vibrio albensis. Сущность изобретения: идентификацию Vibrio albensis осуществляют путем совместного инкубирования испытуемой культуры с индикаторным штаммом. В качестве индикаторного штамма используют штамм Vibrio albensis KM-41, инкубирование проводят в течение 20-24 ч, полученную смесь микроорганизмов прогревают при в течение 40-60 мин, затем высевают ее на газон индикаторного штамма, посев повторно инкубируют и идентификацию проводят по наличию фаголизиса. 1 табл.

щелочном агаре наблюдается помутнение столбика агара),

Рост на твердых питательных ере-- дох: на щелочном агаре (рН 7,) вибрионы образуют через 18 часов роста при 37° колонии правильной формы, диаметром 1,5 мм с влажной, блестящей поверхностью, полупрозрачные в проходящем свете, голубоватые в отраженном.

Рост на жидких питательных средах: на щелочном бульоне, содержащем 100 мкг/мл стрептомицина и без антибиотика, дает помутнение без образования пленки.1

Биохимическая активность штамма:

Штамм разлагает глюкозу, сахарозу, маннит с образованием кислоты без газа, не расщепляет маннозу и арабино- 5 зу.

Декарбоксилирует лизич, не расщепляет -аргинин, не образует сероводо0

5

0

5

дают зону фаголизиса.

Штамм светится в темноте фосфорическим блеском. Выявить свечение можно после адаптации глаз в течение 10 минут. Свечение выявляется лучше у культуры, выращенной в 1% пептон- ной воде, в бульоне Мартена ярче в пленке (рН 7,6-7,8) после инкубирования посевов при 37° в течение суток, на агаре Мартена, в полужидком агаре. На плотных средах периферия посевов светится ярче в посевах на секторах наблюдается свечение всего сектора.

Фагочувствительность штамма определяют по Грациа,при этом вносят 0, мл -часовой бульонной культуры штамма 1193С в 4 мл 0,7% агара Мартена и выливают на агаровую пластинку, затем на газон культуры наносят в виде дорожки каплю фага. Штамм-индикатор стабильно выявляет фагопро- дукцию лизогенных штаммов.

Активное г..- i,T,;j,MMa прогаерй гсн также при посеве 0,5 мл бульонной культуры в 4 мл 0,7% агара с последующим нанесением на газон индикатора капли надосадочной жидкости,прогретой при 5.6° 40 минут бульонной культуры лизо- генного чувствительного к стрептоми- цину штаммп-продуцента йага в виде дорожки.

Способ, условия и состав сред для хранения: штамм в ампулах в лиофили- зиропанном состоянии при 4 , в полужидком 0,3 щелочном агаре при комнатной температуре, на скошенном агаре в пробирках при комнатной температуре.

Способ, условия и состав размножения штамма: Посев микробной взвеси из ампулы производится на щелочной агар (рИ 7,6-7,8), затем пересевается на щелочной агар.

Условия и состав сред для продукции продуктов жизнедеятельности клеток: выращивали в щелочном бульоне, щелочном агаре (рН 7,6-7,8) при 37° в течение 24 часов.

Пример 1. Готовят взвесь двух штаммов V.albensis 1193C и V,al- bensis 9504: по 1 петле суточных агаровых культур вносят в одну пробирку с 2. мл бульона Мартена (рН 7,6-7,8) и оставляют на 20 часов при 37 . Затем смесь культур прогревают при 55° в течение часа и наносят каплю в виде дорожки на газон штамма V.albensis 1193С, предварительно засеянного вслоеО,7% агара на пластинку 1,5% агара Мартена.

Учет проводят через 24 часа выращивания посевов при на месте нанесения капли образуется зона просветления газона. Идентифицируемый штамм 9504 относят к Vibrio albensis.

Пример 2. Выполняют аналогично примеру 1, но используют для прогревания смеси культур V.albensis И93С и 950 и температуру 56 С в течение 40 минут.

Пример 3. Выполняют как описано в примере 1, используя смесь двух штаммов V.albensis 1193C и 9510. Смесь культур прогревают при 57°С в течение 60 мин.

Пример Ц. 0,5 мл 4-часовой бульонной культуры нелизогенного штамма V.albensis 2853 вносят в 5 мл 057% агара и засевают двухслойным методом, 1 каплю фа голи за та 9504 наносят Е, виде дорожки на газон V.nlben sis 2П53. После инкубирования посевов при 37° в течение 24-48 часов учитывают результаты. Зона лизиса культуры .определяет принадлежность нелизогенного штамма 2853 к Vibrio albensis.

Для осуществления такого способа

идентификации было изучено 39 штаммов V.albensis (синоним V.phosphorrscens), в группу которых, вошли также два се- ротипированных штамма V.albensis Р- 9504 (серотип 5), Р-95Ю (серотип 6),

предложенные Гальцевой с соавт. для получения агглютинирующих сывороток светящихся вибрионов.

Нп основании фаголизиса индикаторного штамма светящихся вибрионов были

идентифицированы 15 лизогенных штаммов V.albensis, три из которых через 4 года хранения в столбике агара под вазелиновым маслом утратили способность светиться. 12 штаммов V.albensis не содержали в супернатанте фагов, В связи с этим штаммы были проверены на лизабельность, фагами полученными из культур V.albensis. В таблице представлены результаты повышения числа идентифицированных штаммов за счет дополнительного испытания двух фагов 9504 и 9510, выделенных по предлагаемому способу из одноименных штаммов ( серотипов соответственно).

Как видно из таблицы, по предлагаемому способу идентифицировано 27 штаммов, по известному способу - 12, т.е. эффективность лабораторной

0 диагностики повышается более чем в 2 раза.

Проведение экспериментов показало, что фаги V.albensis отключаются от холерных и V.cholerae не 01 груп5 пы высокой чувствительностью к хлороформу. Поэтому для инактивации клеток .смешанной культуры используют прогревание при в течение 40- 60 минут.

0 Таким образом, способ повышает эффективность лабораторной диагностики V.albensis с положительным и отрицательным феноменом свечения. Он может быть использован при работе с боль5 шим набором штаммов V.albensis, неагглютинирующихся холерными сыворотками и сыворотками к НАГ-зибрионам, Практическую ценность представляет выделение фагов из штаммов V.albensis

7 1 950 и 9510 известных серотипов (5 и 6 серовары), что обеспечивает получе ние диагностических препаратов фагов светящихся вибрионов. Использование препаратов Лагов 950 и 9510 позволя ет идентифицировать иелизогенные штаммы v.albensis, что улучшает лабораторную диагностику светящихся вибрионов.

Формула изобретения , Способ идентификации Vibrio alben- sis путем совместного инкубирования

39

15

8

0

испытуемой культуры с индикаторным штаммом и учетом результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения достоверности способа, в качестве индикаторного штамма используют штамм Vibrio albensis , инкубирование проводят в течение 20- 2k ч, полученную смесь микроорганизмов прогревают при 55-57°С в течение tO-60 мин, затем высевают ее на газон индикаторного штамма, посев повторно инкубируют и идентификацию проводят по наличию Фаголизиса.

11

12