СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ N-НИТРОЗО- N-[(2-ХЛОРЭТИЛ)КАРБАМОИЛ]-L-ЛИЗИНА И N-[(2-ХЛОРЭТИЛ)-N-НИТРОЗОКАРБАМОИЛ]-L-ЛИЗИНА Российский патент 2011 года по МПК C07C273/18 C07C275/68 

Изобретение относится к области фармацевтической химии, а именно к способу получения индивидуальных (2-хлорэтил)нитрозоуреидопроизводных L-лизина.

Противоопухолевый препарат "Лизомустин" (Свидетельство на товарный знак «Лизомустин» №236592, зарегистрирован 28.01.2003 г.) представляет собой смесь изомеров положения нитрозогруппы: N^ε-нитрозо-N^ε-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-лизина (1) и N^ε-[(2-хлорэтил)-N-нитрозокарбамоил]-L-лизина (2), в соотношении 75:25. Способ получения смеси изомеров описан в патенте РФ №1744946 «Способ получения смеси изомеров 9-(2-хлорэтил)-7-нитрозо-L-гомоцитруллина и 9-(2-хлорэтил)-9-нитрозо-L-гомоцитруллина». Препарат разрешен для лечения онкологических заболеваний [Гос. рег. №ЛС-002311 от 01.12.2006].

Количественное определение содержания смеси изомеров в препарате проводят спектрофотометрическим методом [Аналитика и контроль. 2001. Т.5, №2. С.168-170], определение соотношения изомеров проводят методом обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии [Аналитика и контроль. 2001. Т.5, №2. С.143-145]. Данные методы являются относительными, и для их использования необходимо применение индивидуальных образцов каждого изомера препарата "Лизомустин".

Известен способ получения индивидуальных изомеров препарата «Лизомустин» с использованием синтетических методов, которые отличаются низким выходом, длительностью и использованием токсичных реагентов [Хим.-фармац. Журнал. 1996, №5. С.23-25].

Изомер 1 получают после длительной (120-140 ч) выдержки при комнатной температуре водного раствора смеси изомеров и концентрирования раствора с последующим выделением и перекристаллизацией. Выход соединения 1 составляет 53% от содержания изомера 1 в исходной смеси. Для получения изомера 2 используют региоселективный метод, основанный на применении «активированных» N-алкилнитрозокарбаматов. Данный способ основан на карбамоилировании медного комплекса L-лизина пентахлорфениловым эфиром N-(2-хлорэтил)-N-нитрозокарбаминовой кислоты. Полученный медный комплекс разлагают сероводородом в разбавленной HCl и выделяют соединение 2 нейтрализацией водным аммиаком. Очистку соединения 2 проводят дополнительным переосаждением из разбавленной HCl водным раствором аммиака. Общий выход соединения 2 в расчете на гидрохлорид L-лизина составляет около 20%.

Задачей изобретения является получение индивидуальных изомеров с сохранением их строения, с высокими выходом и чистотой продуктов, без использования высокотоксичных соединений.

Для анализа и препаративного разделения аминокислот со свободными карбоксильными и аминогруппами в α положении молекул используют методы ионообменной и обращенно-фазовой хроматографии [Л.А.Остерман «Хроматография белков и нуклеиновых кислот». М.: Наука, 1985. С.194-206; с.515-527. А.Хеншин, К.-П.Хупе и др. «Высокоэффективная хроматография в биохимии». М.: Мир, 1988. С.171-260]. В этих методах, как правило, используют буферные системы, которые переводят структуру карбоксильной и аминогруппы в одно из равновесных состояний, кроме того, часто используются ион-парные реагенты, в частности додецилсульфонат натрия.

Соединения 1 и 2 относятся к производным аминокислоты лизина, содержащим свободные амино- и карбоксильные группировки в α положении молекулы, в тоже время в структуре молекул соединений 1 и 2 находятся нестабильные 2-хлорэтилнитрозо-карбамоильные группировки в ε положении. Наличие подобных группировок в сочетании с достаточно высокой растворимостью данных соединений в воде не позволяет проводить их концентрирование и отделение от неорганических компонентов буферных систем. Поэтому применение широко используемых в обращенно-фазовой ВЭЖХ подвижных фаз, содержащих буферные растворы, является не пригодным для получения индивидуальных изомеров 1 и 2.

Поставленная задача решается путем использования препаративной ВЭЖХ в обращенно-фазовом варианте с применением в качестве подвижной фазы раствора изопропилового спирта в воде с концентрацией 2-5% (неподвижная фаза - октадецилсиликагель) при скорости подачи подвижной фазы 4,0-8,0 мл/мин и объеме вводимой пробы не более 2,6% от объема колонки.

При несоблюдении указанных параметров - состава подвижной фазы (концентрации изопропилового спирта в воде) и скорости ее подачи, ухудшается разделение соединений 1 и 2 (уменьшается коэффициент разделения) и/или увеличивается время процесса, что приводит к снижению выходов целевых соединений.

Для получения соединений 1 и 2 используется следующее оборудование: система в составе: насос «Gilson 305» 25 SC, инжектор «Rheodyne 7010» с петлей 2,0 мл, УФ-детектор «LCD 2070» с фиксированной длиной волны 254 нм, колонка размерами 250×20 мм, заполненная сорбентом марки «Reprosil-Pur C₁₈», со средним размером гранул сорбента d_r=10 мкм, удельной поверхностью S_уд=300 м²/г и размером пор r=100 Å, предварительно уравновешенная подвижной фазой. Температура колонки комнатная 20-24°С. Отбор фракций производят по показаниям детектора и по показаниям самопишущего потенциометра (использован самописец TZ-4620, Чехия) от начала сигнала до выхода показаний на нулевую линию.

Собранные фракции упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40°С, высушивают в вакууме до постоянного веса.

Подлинность и индивидуальность полученных соединений подтверждают данными аналитической ВЭЖХ и спектроскопией ¹Н ЯМР.

Характеристики полученных образцов полностью соответствуют веществам, описанным в [Хим. - фармац. Журнал, 1996, №5. С.23-25].

Заявляемый способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. 2,0 мл раствора субстанции препарата «Лизомустин», содержащей изомеры 1 и 2 в соотношении 75:25 с концентрацией 20,0 мг/мл в 3,0% изопропанол в воде (подвижная фаза), вводят в колонку препаративного жидкостного хроматографа. Соотношение объема пробы к объему колонки составляет 2,6%. Расход подвижной фазы - 6,0 мл/мин. Температура колонки комнатная 20-24°С. Отбор фракций производят по показаниям детектора и по показаниям самопишущего потенциометра, от начала сигнала до выхода показаний на нулевую линию, средний объем полученных фракций составляет 20,0 мл. Собирают фракцию с временем удерживания T₁=45,0±1,0 мин и после упаривания получают 29,7 мг изомера 1 (выход 99,0% от содержания изомера 1 в исходном образце); после упаривания фракции с временем удерживания Т₂=55,2±1,0 мин получают 9,0 мг изомера 2 (выход 90,0% от содержания изомера 2 в исходном образце).

Пример 2. Согласно примеру 1 расход подвижной фазы 8,0 мл/мин. Изомер 1: время удерживания T₁=33,8±1,0 мин (выход 29,6 мг, 98,8% от содержания изомера 1 в исходном образце). Изомер 2: время удерживания Т₂=41,4±1,0 мин (выход 9,6 мг, 96,0% от содержания изомера 2 в исходном образце).

Пример 3. Согласно примеру 1 расход подвижной фазы 4,0 мл/мин. Изомер 1: время удерживания T₁=67,5±1,0 мин (выход 29,2 мг, 97,3% от содержания изомера 1 в исходном образце). Изомер 2: время удерживания Т₂=82,5±1,0 мин (выход 9,8 мг, 98,0% от содержания изомера 2 в исходном образце).

Пример 4. Согласно примеру 1 расход подвижной фазы (2% раствор изопропанола в воде) 6,0 мл/мин. Изомер 1: время удерживания T₁=64,5±1,0 мин (выход 29,2 мг, 97,3% от содержания изомера 1 в исходном образце). Изомер 2: время удерживания Т₂=83,5±1,0 мин (выход 9,8 мг, 98,0% от содержания изомера 2 в исходном образце).

Пример 5. Согласно примеру 1 расход подвижной фазы (5% раствор изопропанола в воде) 6,0 мл/мин. Изомер 1: время удерживания T₁=35,5±1,0 мин (выход 29,6 мг, 98,7% от содержания изомера 1 в исходном образце). Изомер 2: время удерживания Т₂=42,5±1,0 мин (выход 9,6 мг, 96,0% от содержания изомера 2 в исходном образце).

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет получать индивидуальные изомеры препарата «Лизомустин» с высокой степенью чистоты с препаративным выходом, без использования высокотоксичных соединений.

Предложен новый способ получения индивидуальных N^ε-нитрозо-N^ε-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-лизина и N^ε-[(2-хлорэтил)-N-нитрозокарбамоил]-L-лизина, в котором применяют метод препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенно-фазовом варианте, с использованием в качестве подвижной фазы раствора изопропилового спирта в воде с концентрацией 2-5% и скоростью подачи подвижной фазы 4,0-8,0 мл/мин, при этом объем пробы составляет не более 2,6% от объема колонки. Технический результат заключается в достижении более высоких выходов индивидуальных соединений.

Способ получения индивидуальных N^ε-нитрозо-N^ε-[(2-хлорэтил)карбамоил] -L-лизина и N^ε-[(2-хлорэтил)-N-нитрозокарбамоил] -L-лизина, отличающийся тем, что применяют метод препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенно-фазовом варианте с использованием в качестве подвижной фазы раствора изопропилового спирта в воде с концентрацией 2-5% и скоростью подачи 4,0-8,0 мл/мин, при этом объем пробы составляет не более 2,6% от объема колонки.