Штамм бактерий VIвRIо сноLеRае 042 серовара, используемый в качестве индикаторной культуры для выявления умеренного фага 042/1 серовара и его вирулентных мутантов Советский патент 1990 года по МПК C12N1/20 C12N7/00 C12N1/20 C12R1/63 

Б В

20

25

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть ис- . Шользовано при диагностике НАГ-инфек- 1)1ий.5

Цель изобретения - изыскание штамма, способного выявлять умеренный фаг нового серотипа OA2/I и обеспе- Ч|Ивать в качестве штамма-ментора раз- | ножение вирулентных мутантов этого 10 фага.

Штамм V.cholerae выделен из объектов окружающей среды и депонирован П|од номером КМ-13(С-170).

; Штамм КМ-13(С-170) характеризуется 15 следующими свойствами.

Культурально-морфологические при- эмаки.

j Подвижные, слегка изогнутые палоч:- к 1,6-2,9 мкм в длину и 0,2-0,6 мкм в1 ширину, с одним полярно расположе- ньтм жгутиком, спор и капсул не образуют, грамотрицательны.

На твердых питательных средах

(агар Мартена, агар Хоттингера,-щелочной мясо-пептонный агар рН 7,6± iO,2) обрадует круглые, полупрозрачные, 3-4 мм в-диаметре колонии с р|овным краем, слегка уплотненным ь(ентром через 18 ч выращивания при .

На жидких питательных средах (бу- Льон Мартена, бульон Хоттингера, 1|%-ная пептрнная вода (рН 7,8+0,2)) о|бразует равномерную муть и нежную п{ленку на поверхности через 6 ч вы- р|ащивания при .

Физиолого-биохимические свойства. Тест на оксидазу положителен, р азлагает до кис;лоты без газа манно- зу, сахарозу, глюкозу, маннит, не ферментирует арабинозу, инозит, лак- Тозу, на среде Хью-Лейфсона фермен- пирует и окисляет глюкозу, образует декарбоксилазу лизина, не образует дигидролазу аргинина, ферментирует К1рахмал и желатин, не растет при кон- , и|ентрации 7-10% хлорида натрия. Серологические свойства. Не агглютинируется холерными диаг-м Йостичёскими сыворотками 0,RO, Инаба, Огава, агглютинируется моноварной в|ибрионной сывороткой 042 серовара, Hie агглютинируется моновярными виб- {1{ионными сыворотками других (02-041, 043-056) О сероваров.

Способен выявлять и обеспечивать репродукцию умеренного фяга 042/1 серотипа и его вирулентных мутантов.

30

35

40

45

55

Умеренные и вирулентные фаги 04271 серотипа формируют на газоне штамма С-170 негативные колонии типичной морфологии.

Колонии умеренного фага 042/1 серотипа имеют круглую форму 5±1 мм в диаметре, с плотным центром и узкой зоной неполного лизиса по периферии. Негативные колонии вирулентИых мутантов отличаются от исходного умеренного варианта прозрачным центром.

По электронно-микроскопической структуре фаги 042/1 серотипа относятся к II морфологической группе А.С. Тихоненко.Они имеют маленькую головку 300±32 А в диаметре и лишены отростка. Одиночный цикл вирулентного мутанта 781/781 в/С-170 фага 042/1 серотипа характеризуется минимальным латентным периодом 31±1 мин и средним урожаем 20+3 частиц на одну инфицированную клетку. Вирулентные мутанты фага 042/1 обладают практически ценным свойством - специфически лизировать 86-90% штаммов энтеро- патогенных вибрионов V.cholerae .042 серовара, что может быть использовано при лабораторной диагностике НАГ-ии- фекций.

i

Размножается штамм С-170 в бульо- ,

не и на агаре Мартена (рН 7,6+0,2), хранят его в лиофилизированном сос-- тоянии.

Спектр действия фага показан в таблице.

Использование штамма иллюстрируется следзгющим примером.

Пример. Индикаторные свойства штамма С-170 в отношении умеренных фагов 042/Г серотипа и его вирулентных мутантов выявляют в следующем опыте методом Грациа и капли.

Фильтрат суточной бульонной культуры щтамма (КМ-14) Vibrio chole- rae 042 серовара или другого штамма того же серовара, исследуемого на лизогению, в количестве 1,0 мл смешивают с 0,2 мл бульонной трехчасо-г вого роста культурой штамма С-170 и 5,0 мл 0,7%-ного агара Мартена (пред- варительно расплавленного и охлажденного до 45 с) и вьщивают на пластинку 2%-ного агара Мартена в,чатке Петри. После застывания нанесенного слоя чашку переаертьгаают и культивируют при 37 С 18-20 ч (метод Грациа).

Бульонную культуру трехчасового роста штамма С-170 вносят в количестве 0,5 WI в 5,0 мл 0,7%-ного агара Мартена, тщательно перемешивают и выливают на поверхность пластинки 2%-ного агара Мартена в чашке Петри. На-застывшую поверхность наносят каплю исследуемого фильтрата. При наличии небольшого количества корпускул фага в фильтрате он обнаруживается -методом Грациа в виде изолированных негативных колоний на газоне штамма С-170. При высокой концентрации фага в фильтрате его обнаруживают методом капли в виде сливного литического пятна на газоне штамма С-170 на мест нанесения фильтрата.

Дпя получения вирулентного фага с первой чашки отбирают прозрачную колонию, уколом платиновой иглы фаз из нее переносят в 0,1 мл бульона Мартена и концентрируют на твердой среде по методу Адамса с применением в качестве штамма-ментора V.chole- гае 042 С-170. Полученный концентрат

фага размножают в жидкой среде на штамме С-170. К 100,0 мл бульона Мар- тана добавляют трехчасовую бульонную культуру штамма в количестве 2 мл (540 микробных тел в S мл) к концентрат фага из расчета множественности инфекции 15:1. Посев культивируют при З7 с в течение 2,5+0,2 ч до просветления микробной взвеси, после чего стерилизуют фильтрацией через фарфоровые бактериальные фильтры марки Ф-5, контролируют на стерильность и применяют по назначению.

Концентрация частиц препарата вирулентного мутанта фага 042/ серо- типа 781/781 в/170, размноженного в указанных условиях, равна частиц на I мл.

Формула изобретения

Штамм бактерий Vibrio cholerae 042 серовара KM-13(C-S70), используемый качестве индикаторной культуры ля выявления умеренного фага 0,42/1 еровара и его вирулентных мутантов.

Спмтр. дМетят спвцнфичкоегь ФАГВ ) С-170

-

56