ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КОНСОРЦИУМА АЗОТФИКСИРУЮЩИХ И ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 C05F11/08 

Изобретение относится к области создания биопрепаратов на основе индивидуальных микроорганизмов и их сочетаний (консорциумов) и может быть использовано в микробиологии и сельском хозяйстве.

Известна питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, карбонат кальция, сахарозу и воду [1].

Недостатком данной питательной среды является относительно низкая скорость роста на ней азотфиксирующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, что делает ее малопригодной для выращивания их консорциума.

Известна питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая глюкозу, аспарагин, сульфат калия, кукурузный экстракт, хлорид кальция, фосфат натрия и воду [2].

Недостатком данной питательной среды является относительно низкая скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста азотфиксирующих микроорганизмов, что делает ее малопригодной для выращивания их консорциума.

Наиболее близким к заявляемому нами объекту по совокупности признаков и достигаемому техническому эффекту является питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду [3].

Недостатком данной питательной среды, которая в связи с только что отмеченным обстоятельством выбрана нами в качестве объекта-прототипа, также является сравнительно низкая скорость роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов и, значит, и их консорциума в целом.

Целью данного изобретения является увеличение скорости роста фосфатмобилизующих микроорганизмов при сохранении или небольшом снижении скорости роста азотфиксирующих микроорганизмов при выращивании консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов.

Указанная цель достигается тем, что питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II) и воду, дополнительно содержит вермикулит при следующем соотношении компонентов, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.60-0.70 Гидрофосфат калия 0.12-0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.15-0.25 Хлорид натрия 0.15-0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.02-0.06 Молибдат натрия 0.0005-0.0007 Сульфат железа(II) 0.002-0.004 Сахароза 18.0-22.0 Вермикулит 0.9-1.6 Вода дистиллированная до 1 л

В результате использования данной питательной смеси скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов несколько снижается, тогда как скорость роста фосфатмобилизующих возрастает в 6-7 раз по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [3].

До настоящего времени в литературе не была кем-либо описана питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая вышеуказанную совокупность ингредиентов вообще и вермикулит в частности, да и само применение последнего в составе питательных сред для выращивания микроорганизмов неизвестно вообще. Это обстоятельство дает нам основание считать, что заявляемый нами объект подпадает под первый критериальный признак изобретения, установленный патентным законодательством РФ, - новизна. Сопоставление известных признаков питательной среды-прототипа [3] и отличительных признаков, характеризующих заявляемый нами объект (а именно - введение в нее вермикулита), не позволяет предсказать априори появления у него новых по сравнению с прототипом свойств, а именно указанного выше значительного увеличения скорости роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, входящих в состав вышеуказанного консорциума, при небольшом снижении скорости роста азотфиксирующих. Данный факт позволяет сделать заключение, что заявляемый нами объект явным образом не следует из известного в данной отрасли техники уровня и подпадает под второй установленный законодательством РФ критериальный признак изобретения, а именно изобретательский уровень. Предлагаемая нами питательная среда достаточно легко может быть получена в промышленном масштабе, ее применение для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов осуществимо без каких-либо проблем, так что заявляемый объект подпадает и под третий критериальный признак изобретения РФ - промышленная применимость.

Заявляемая на предмет изобретения питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1

Приготавливают питательную среду для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.60 Гидрофосфат калия 0.12 Сульфат магния гептагидрат 0.15 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.02 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.002 Сахароза 18.0 Вермикулит 0.9 Вода дистиллированная до 1 л

Составляют консорциум азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов на основе коллекционных (депонированных) штаммов поименованных микроорганизмов (Pseudomonas brassicacearum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10388) и (Sphingobacterium multivorum. Регистрационный номер в ВКПМ В-10385), соответственно с соотношением 1:1 по количеству КОЕ (колониеобразующих единиц). Для этого предварительно выращивают азотфиксирующие микроорганизмы на агаризованной среде Эшби, а фосфатмобилизующие - на агаризованной среде Муромцева, после чего обе эти культуры высеваются на питательную среду указанного выше состава. Выращивание ведут в течение того периода времени, в котором имеет место прирост их численности (5.5 сут), после чего этот процесс прекращают. Для определения численности микроорганизмов сразу же проводят посев консорциума на агаризованные питательные среды (среда Эшби в случае азотфиксирующих и среда Муромцева - в случае фосфатмобилизирующих) и определяют среднюю скорость их роста в (млн·г^-1·сут^-1) как частное от деления числа микроорганизмов (в миллионах единиц) на массу питательной среды (в г) и время выращивания (в сут). Итоговые результаты по определению скорости роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов для вышеуказанной питательной среды представлены в Таблице 1.

Пример 2

Проводят по общей технологической схеме Примера 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидра т 0.05 Молибдат натрия 0.0006 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Вермикулит 1.3 Вода дистиллированная до 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для указанного случая приведены в Таблице 1.

Пример 3

Выполняют, как и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.70 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.25 Хлорид натрия 0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.06 Молибдат натрия 0.0007 Сульфат железа(II) 0.004 Сахароза 22.0 Вермикулит 1.6 Вода дистиллированная до l л

Результаты по определению скорости роста поименовавнных выше микроорганизмов для данного случая показаны в Таблице 1.

Пример 4 (сравнительный)

Осуществляют по той же схеме, что и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов приготавливают питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Вермикулит 0.7 Вода дистиллированная до 1 л

Результаты по определению скорости роста вышеуказанных микроорганизмов для этого случая даны в Таблице 1.

Пример 5 (сравнительный)

Выполняют как и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Вермикулит 2.0 Вода дистиллированная до 1 л

Показатели скорости роста микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.

Пример 6 (сравнительный)

Проводят как и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.50 Гидрофосфат калия 0.09 Сульфат магния гептагидрат 0.10 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.015 Молибдат натрия 0.0003 Сульфат железа(II) 0.001 Сахароза 14.0 Вермикулит 1.3 Вода дистиллированная до 1 л

Показатели скорости роста микроорганизмов для данного случая показаны в Таблице 1.

Пример 7 (сравнительный)

Выполняют как и Пример 1, но выращивание консорциума вышеуказанных микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.90 Гидрофосфат калия 0.30 Сульфат магния гептагидрат 0.30 Хлорид натрия 0.35 Сульфат кальция дигидрат 0.09 Молибдат натрия 0.0010 Сульфат железа(II) 0.006 Сахароза 28.0 Вермикулит 1.3 Вода дистиллированная до 1 л

Показатели скорости роста обоих этих микроорганизмов для данного случая даны в Таблице 1.

Пример 8 (сравнительный)

Осуществляют так же, как и Пример 1, но для выращивания консорциума микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.50 Гидрофосфат калия 0.09 Сульфат магния гептагидрат 0.10 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.015 Молибдат натрия 0.0003 Сульфат железа(II) 0.001 Сахароза 14.0 Вермикулит 2.0 Вода дистиллированная до 1 л

Значения скорости роста микроорганизмов для данного случая приведены в Таблице 1.

Пример 9 (сравнительный)

Выполняют таким же образом, как и Пример 1, но выращивание консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.90 Гидрофосфат калия 0.30 Сульфат магния гептагидрат 0.30 Хлорид натрия 0.35 Сульфат кальция дигидрат 0.09 Молибдат натрия 0.0010 Сульфат железа(II) 0.006 Сахароза 28.0 Вермикулит 2.0 Вода дистиллированная до 1 л

Показатели скорости роста микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.

Пример 10 (по прототипу [3])

Осуществляют с использованием той же технологической схемы, что и в Примере 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Вода дистиллированная до 1 л

Результаты определения скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая также приведены в Таблице 1.

Пример 11 (по аналогу [1])

Проводят с использованием той же технологической схемы, что и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.10 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Карбонат кальция 5.00 Сахароза 20.0 Вода дистиллированная до 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для указанного случая также приведены в Таблице 1.

Пример 12 (по аналогу [2])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Сульфат калия 0.20 Хлорид кальция гексагидрат 3.30 Фосфат натрия додекагидрат 3.80 Кукурузный экстракт 0.20 Глюкоза 10.0 Аспарагин 1.00 Вода дистиллированная до 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая показаны в Таблице 1.

Таблица 1 №примера Содержание вермикулита в питательной смеси, г/л Средняя скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов{Pseudomonas brassicacearum), млн·г^-1·сут^-1 Средняя скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов (Sphingobacterium multivorum), млн·г^-1·сут^-1 1 0.9 29/5.5 1220/5.5 2 1.3 32/5.5 1250/5.5 3 1.6 32/5.5 1240/5.5 4 (сравнительный) 0.7 25/5.5 980/5.5 5 (сравнительный) 2.0 32/5.5 1230/5.5 6 (сравнительный) 1.3 30/5.5 1050/5.5 7 (сравнительный) 1.3 32/5.5 1180/5.5 8 (сравнительный) 2.0 30/5.5 1080/5.5 9 (сравнительный) 2.0 32/5.5 1200/5.5 10 (по прототипу [3]) - 36/5.5 175/5.5 11 (по аналогу [1]) - 55/5.5 6/5.5 12 (по аналогу [2]) - 12/5.5 180/5.5

Как следует из приведенных в Таблице 1 данных, использование заявляемой питательной среды, содержащей вермикулит в количестве (0.9-1.6) г/л, позволяет весьма значительно увеличить скорости роста фосфатмобилизующих (Sphingobacterium multivorum) микроорганизмов при небольшом снижении скорости роста азотфиксирующих (Pseudomonas brassicacearum) в рамках их консорциума по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [3] и сред-аналогов [1] и [2]. Отметим, что заявляемые нами количества вермикулита в питательной смеси являются существенными: при превышении указанного верхнего заявляемого уровня (1.6 г/л) дальнейшего прироста скорости роста как тех, так и других микроорганизмов уже не наблюдается (и даже происходит некоторое ее снижение), при уменьшении же ниже указанного нижнего заявляемого уровня (0.9 г/л) имеет место снижение скорости роста.

Аналогичные результаты были получены нами и на других культурах азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов (в частности, Azotobacter chroococcum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10387 и Achromobacter xylosoxidans, Регистрационный номер в ВКПМ В-10386).

ЛИТЕРАТУРА

1. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. 3-е издание переработанное. Под ред. Н.С.Егорова. М.: Издательство Московского университета. 1995. С.204.

2. Основные микробиологические и биохимические методы исследования почвы (Методические рекомендации) / Под ред. Ю.М.Возняковской. - Л.: ВНИИСХМ, 1987. С.31.

3. Патент РФ 2177466 (2001), МПК C06N 1/08, C12N 1/20 (прототип).

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа (II), сахарозу, вермикулит и воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет увеличить скорость роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов. 1 табл., 12 пр.

Питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа (II), сахарозу и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит вермикулит при следующем соотношении компонентов, г/л:
дигидрофосфат калия 0,60-0,70 гидрофосфат калия 0,12-0,20 сульфат магния гептагидрат 0,15-0,25 хлорид натрия 0,15-0,25 сульфат кальция дигидрат 0,02-0,06 молибдат натрия 0,0005-0,0007 сульфат железа (II) 0,002-0,004 сахароза 18,0-22,0 вермикулит 0,.9-1,6 вода дистиллированная до 1 л