ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КОНСОРЦИУМА АЗОТФИКСИРУЮЩИХ И ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12R1/38 C12R1/01 

Изобретение относится к области создания биопрепаратов на основе индивидуальных микроорганизмов и их сочетаний (консорциумов) и может быть использовано в микробиологии и сельском хозяйстве.

Известна питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, карбонат кальция, сахарозу и воду [1]. Недостатком данной питательной среды является низкая скорость роста на ней азотфиксирующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, что делает ее малопригодной для выращивания их консорциума.

Известна питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая глюкозу, аспарагин, сульфат калия, кукурузный экстракт, хлорид кальция, фосфат натрия и воду [2]. Недостатком данной питательной среды является низкая скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста азотфиксирующих микроорганизмов, что делает ее также малопригодной для выращивания их консорциума.

Известна также питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду [3]. Недостатком данной питательной среды, которая в связи с только что отмеченным обстоятельством выбрана нами в качестве объекта-прототипа, также является сравнительно низкая скорость роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов.

Наиболее близким к заявляемому нами объекту по совокупности признаков и достигаемому техническому эффекту является питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, минеральную добавку - цеолит и воду [4]. Недостатком данной питательной среды, которая в связи с только что отмеченным обстоятельством выбрана нами в качестве объекта-прототипа, также является сравнительно низкая скорость роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов.

Целью данного изобретения является увеличение скорости роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов в процессе выращивания их консорциума.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, минеральную добавку и воду, в качестве минеральной добавки содержит наноцеолит при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.60-0.70 Гидрофосфат калия 0.12-0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.15-0.25 Хлорид натрия 0.15-0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.02-0.06 Молибдат натрия 0.0005-0.0007 Сульфат железа(II) 0.002-0.004 Сахароза 18.0-22.0 Наноцеолит 0.7-1.5 Вода дистиллированная до 1 л

В результате использования данной питательной смеси скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов возрастает в 25-30 раз, скорость роста фосфатмобилизующих - в 2.5-3.0 раза по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [4].

На данный момент времени в литературе не описана питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая вышеуказанную совокупность компонентов вообще и наноцеолит в частности. Это обстоятельство позволяет нам утверждать, что заявляемый нами объект подпадает под первый критериальный признак изобретения, установленный патентным законодательством РФ, а именно новизна. Сопоставление известных признаков питательной среды-прототипа [4] и отличительных признаков, характеризующих заявляемый нами объект (а именно - использование наноцеолита в качестве минеральной добавки), не позволяет предсказать априори появления у него новых по сравнению с прототипом свойств, а именно указанного выше резкого увеличения скорости роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов, составляющих вышеуказанный консорциум. Это обстоятельство дает основание заключить, что заявляемый нами объект явным образом не следует из известного в данной отрасли техники уровня и соответствует второму установленному законодательством РФ критериальному признаку изобретения - изобретательский уровень. Заявляемая нами на предмет изобретения питательная среда достаточно легко может быть получена в промышленном масштабе, не вызывает сколько-нибудь существенных затруднений и ее применение для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, а значит подпадает и под третий критериальный признак изобретения РФ - промышленная применимость.

Заявляемый нами объект иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1

Природный цеолит из Татарско-Шатрашанского месторождения (Дрожжановский район Республики Татарстан) измельчают в муку и смешивают с дистиллированной или деионизированной (обессоленной) водой из расчета 20 г цеолита на 100 мл воды. Полученную смесь обрабатывают ультразвуком в ультразвуковом диспергаторе УЗУ-0,25 мощностью 80 Вт при частоте 18.5 кГц с амплитудой колебаний ультразвукового волновода 5 мкм в течение (5-20) мин при комнатной температуре, в результате чего получается водно-цеолитная суспензия с размерами частиц цеолита от 5 до 100 нм. Приготовленную таким образом суспензию наноцеолита далее используют в качестве одного из компонентов питательной среды для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов.

Пример 2

Готовят питательную среду для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.60 Гидрофосфат калия 0.12 Сульфат магния гептагидрат 0.15 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.02 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.002 Сахароза 18.0 Наноцеолит 0.7 Вода дистиллированная до 1 л

Составляют консорциум азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов на основе коллекционных (депонированных) штаммов поименованных микроорганизмов (Pseudomonas brassicacearum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10388) и (Sphingobacterium multivorum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10385) соответственно, для чего предварительно выращивают азотфиксирующие микроорганизмы на агаризованной среде Эшби, а фосфатмобилизующие - на агаризованной среде Муромцева. После этого обе эти культуры микроорганизмов высеваются на питательную среду указанного выше состава. Выращивание ведут в течение того периода времени, в котором имеет место прирост их численности (6.0 сут), по его достижении этот процесс прекращают. Для определения численности микроорганизмов сразу же проводят посев образовавшегося консорциума на агаризованные питательные среды (среда Эшби в случае азотфиксирующих и среда Муромцева - в случае фосфатмобилизующих микроорганизмов) и определяют среднюю скорость их роста в (млн·г^-1·сут^-1) как частное от деления числа микроорганизмов (в миллионах единиц) на массу питательной среды (в г) и время выращивания (в сут). Итоговые результаты по определению средней скорости роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов для вышеуказанной питательной среды даны в Таблице 1.

Пример 3

Выполняют по общей технологической схеме Примера 2, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов берут питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0006 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Наноцеолит 1.0 Вода дистиллированная до 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая приведены в Таблице 1.

Пример 4

Осуществляют, как и Пример 2, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.70 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.25 Хлорид натрия 0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.06 Молибдат натрия 0.0007 Сульфат железа(II) 0.004 Сахароза 22.0 Наноцеолит 1.5 Вода дистиллированная до 1 л

Данные по определению скорости роста вышеуказанных микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.

Пример 5 (сравнительный)

Выполняют таким же образом, что и Пример 2, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов приготавливают питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Наноцеолит 0.5 Вода дистиллированная до 1 л

Результаты по определению скорости роста поименованных выше микроорганизмов для данного случая приведены в Таблице 1.

Пример 6 (сравнительный)

Проводят, как и Пример 2, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Наноцеолит 2.0 Вода дистиллированная до 1 л

Значения скорости роста микроорганизмов для такого случая приведены в Таблице 1.

Пример 7 (сравнительный)

Осуществляют таким же образом, как и Пример 2, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов берут питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.50 Гидрофосфат калия 0.09 Сульфат магния гептагидрат 0.10 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.015 Молибдат натрия 0.0003 Сульфат железа(II) 0.001 Сахароза 14.0 Наноцеолит 1.2 Вода дистиллированная до 1 л

Сведения о скорости роста микроорганизмов для этого случая см. в Таблице 1.

Пример 8 (сравнительный)

Выполняют, как и Пример 2, но выращивание консорциума вышеуказанных микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.90 Гидрофосфат калия 0.30 Сульфат магния гептагидрат 0.30 Хлорид натрия 0.35 Сульфат кальция дигидрат 0.09 Молибдат натрия 0.0010 Сульфат железа(II) 0.006 Сахароза 28.0 Наноцеолит 1.2 Вода дистиллированная до 1 л

Значения скоростей роста указанных микроорганизмов для рассматриваемого случая см. в Таблице 1.

Пример 9 (сравнительный)

Осуществляют, как и Пример 2, но для выращивания консорциума микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.50 Гидрофосфат калия 0.09 Сульфат магния гептагидрат 0.10 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.015 Молибдат натрия 0.0003 Сульфат железа(II) 0.001 Сахароза 14.0 Наноцеолит 2.0 Вода дистиллированная до 1 л

Данные о скорости роста микроорганизмов для этого случая приведены в Таблице 1.

Пример 10 (сравнительный)

Выполняют таким же образом, как и Пример 2, но выращивание консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов проводят на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.90 Гидрофосфат калия 0.30 Сульфат магния гептагидрат 0.30 Хлорид натрия 0.35 Сульфат кальция дигидрат 0.09 Молибдат натрия 0.0010 Сульфат железа(II) 0.006 Сахароза 28.0 Наноцеолит 2.0 Вода дистиллированная до 1 л

Данные скорости роста микроорганизмов для этого случая см. в Таблице 1.

Пример 11 (по прототипу [4])

Выполняют по той же технологической схеме, что и в Примере 2, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0006 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Цеолит 1.5 Вода дистиллированная до 1 л

Сведения о скорости роста микроорганизмов для этого случая даны в Таблице 1.

Пример 12 (по прототипу [4])

Выполняют по той же технологической схеме, что и в Примере 2, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.70 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.25 Хлорид натрия 0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.06 Молибдат натрия 0.0007 Сульфат железа(II) 0.004 Сахароза 22.0 Цеолит 2.0 Вода дистиллированная до 1 л

Результаты по определению скорости роста микроорганизмов для этого случая представлены в Таблице 1.

Пример 13 (по аналогу [3])

Выполняют с использованием той же общей схемы, что и в Примере 2, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Вода дистиллированная до 1 л

Сведения о скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая приведены в Таблице 1.

Пример 14 (по аналогу [1])

Выполняют с использованием той же технологической схемы, что и Пример 2, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.10 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Карбонат кальция 5.00 Сахароза 20.0 Вода дистиллированная до 1 л

Показатели скорости роста микроорганизмов для данного случая приведены в Таблице 1.

Пример 15 (по аналогу [2])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 2, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Сульфат калия 0.20 Хлорид кальция гексагидрат 3.30 Фосфат натрия додекагидрат 3.80 Кукурузный экстракт 0.20 Глюкоза 10.0 Аспарагин 1.00 Вода дистиллированная до 1 л

Показатели, характеризующие рост микроорганизмов для рассматриваемого случая, также приведены в Таблице 1.

Таблица 1 № примера Содержание наноцеолита в питательной смеси, г/л Средняя скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов (Pseudomonas brassicacearum), млн·г^-1·сут^-1 Средняя скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов [Sphingobacterium multivorum), млн·г^-1·сут^-1 2 0.7 158.3 358.3 3 1.0 166.7 366.7 4 1.5 163.3 361.7 5 (сравнительный) 0.5 133.3 290.0 6 (сравнительный) 2.0 146.7 321.7 7 (сравнительный) 1.2 151.6 330.0 8 (сравнительный) 1.2 153.3 320.0 9 (сравнительный) 2.0 130.0 283.3 10 (сравнительный) 2.0 130.0 290.1 11 (по прототипу [4])   5.8 123.3 12 (по прототипу [4])   5.8 123.5 13 (по аналогу [3]) - 6.0 29.2 14 (по аналогу [1]) - 9.2 1.0 15 (по аналогу [2]) - 2.0 30.0

Как можно видеть из приведенных в Таблице 1 данных, использование заявляемой нами питательной среды, содержащей наноцеолит в количестве (1.0-2.0) г/л, позволяет резко увеличить скорость роста фосфатмобилизующих (Sphingobacterium muttivorum) и в еще большей степени - скорость роста азотфиксирующих (Pseudomonas brassicacearum) микроорганизмов в рамках их консорциума по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [4] и тем более - для сред-аналогов [1], [2] и [3]. Отметим, что заявляемые нами количества наноцеолита в питательной смеси являются существенными: при превышении указанного верхнего заявляемого уровня (2.0 г/л) дальнейшего прироста скорости роста как тех, так и других микроорганизмов уже не наблюдается (и даже происходит некоторое ее снижение), при уменьшении же ниже указанного нижнего заявляемого уровня (1.0 г/л) имеет место снижение скоростей роста обоих типов микроорганизмов.

Аналогичные результаты были получены нами и на других культурах азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов (в частности Azotobacter chroococcum, регистрационный номер в ВКПМ В-10387 и Achromobacter xylosoxidans, регистрационный номер в ВКПМ В-10386).

ЛИТЕРАТУРА

[1] Руководство к практическим занятиям по микробиологии. 3-е издание переработанное, под ред. Н.С. Егорова. - М: Издательство Московского университета. 1995. С.204.

[2] Основные микробиологические и биохимические методы исследования почвы (Методические рекомендации) / Под ред. Ю.М. Возняковской. - Л.: ВНИИСХМ, 1987. С.31.

[3] Патент РФ 2.177.466 (2001), МПК C05F 11/08, C12N 1/20.

[4] Заявка на изобретение РФ №2012145907 от 26.10.2012, МПК C12N 1/00, C12N 1/20, C12N 1/22 (прототип).

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, наноцеолит и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить скорость роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов. 1 табл., 15 пр.

Питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, минеральную добавку и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве минеральной добавки она содержит наноцеолит при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
Дигидрофосфат калия 0.60-0.70 Гидрофосфат калия 0.12-0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.15-0.25 Хлорид натрия 0.15-0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.02-0.06 Молибдат натрия 0.0005-0.0007 Сульфат железа(II) 0.002-0.004 Сахароза 18.0-22.0 Наноцеолит 0.7-1.5 Вода дистиллированная до 1 л