ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КОНСОРЦИУМА АЗОТФИКСИРУЮЩИХ И ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12N1/22 C12R1/01 

Изобретение относится к области создания биопрепаратов на основе индивидуальных микроорганизмов и их сочетаний (консорциумов) и может быть использовано в микробиологии и сельском хозяйстве.

Известна питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая глюкозу, аспарагин, сульфат калия, кукурузный экстракт, хлорид кальция, фосфат натрия и воду [1]. Недостатком данной питательной среды является относительно низкая скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста азотфиксирующих микроорганизмов, что делает ее малопригодной для выращивания их консорциума.

Известна питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, карбонат кальция, сахарозу и воду [2]. Недостатком данной питательной среды является относительно низкая скорость роста на ней азотфиксирующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, что также делает ее малопригодной для выращивания их консорциума.

Наиболее близким к заявляемому нами объекту по совокупности признаков и достигаемому техническому эффекту является питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду (т.н. среда Берка) [3]. Недостатком данной питательной среды, которая в связи с только что отмеченным обстоятельством выбрана нами в качестве объекта-прототипа, также является сравнительно низкая скорость роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов, и, следовательно, их консорциума в целом.

Цель настоящего изобретения - увеличение скорости роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов на питательной среде при выращивании консорциума на их основе.

Декларируемая цель достигается тем, что в питательную среду для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащую дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II) и воду, дополнительно вводят бентонит при следующем соотношении ингредиентов (г/л):

Дигидрофосфат калия 0.60-0.70 Гидрофосфат калия 0.12-0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.15-0.25 Хлорид натрия 0.15-0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.02-0.06 Молибдат натрия 0.0005-0.0007 Сульфат железа(II) 0.002-0.004 Сахароза 18.0-22.0 Бентонит 1.0-1.8 Вода дистиллированная До 1 л

В результате использования данной питательной смеси скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов возрастает в 3-4 раза, фосфатмобилизующих - в 6-8 раз по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [3].

До настоящего времени в литературе не была кем-либо описана питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая вышеуказанную совокупность ингредиентов вообще и бентонит, в частности; более того, применение бентонита в составе питательных сред для выращивания микроорганизмов неизвестно вообще. Это обстоятельство дает нам основание считать, что заявляемый нами объект соответствует первому критериальному признаку изобретения, установленному патентным законодательством РФ, - новизна. Сопоставление известных признаков питательной среды-прототипа [3] и отличительных признаков, характеризующих заявляемый нами объект (а именно - введение в нее бентонита), не позволяет предсказать априори появления у него новых по сравнению с прототипом свойств, а именно указанного выше значительного увеличения скорости роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов, входящих в состав вышеуказанного консорциума. Данный факт позволяет сделать заключение, что заявляемый нами объект явным образом не следует из известного в данной отрасли техники уровня, а значит, соответствует второму установленному законодательством РФ критериальному признаку изобретения - изобретательский уровень. Предлагаемая нами питательная среда достаточно легко может быть получена в промышленном масштабе и ее применение для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов осуществимо без каких-либо проблем, так что заявляемому нами объекту присущ и третий установленный законодательством РФ критериальный признак изобретения - промышленная применимость.

Заявляемая на предмет изобретения питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1

Приготавливают питательную среду для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.60 Гидрофосфат калия 0.12 Сульфат магния гептагидрат 0.15 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.02 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.002 Сахароза 18.0 Бентонит 1.0 Вода дистиллированная До 1 л

Составляют консорциум азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов на основе коллекционных (депонированных) штаммов поименованных микроорганизмов (Pseudomonas brassicacearum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10388) и (Sphingobacterium multivorum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10385), соответственно. Для этого предварительно выращивают азотфиксирующие микроорганизмы на агаризованной среде Эшби, а фосфатмобилизующие - на агаризованной среде Муромцева, после чего обе эти культуры высеваются на питательную среду указанного выше состава. Выращивание ведут в течение того периода времени, в котором имеет место прирост их численности (4 сут), после чего этот процесс прекращают. Для определения численности микроорганизмов сразу же проводят посев консорциума на агаризованные питательные среды (среда Эшби в случае азотфиксирующих и среда Муромцева - в случае фосфатмобилизирующих) и определяют среднюю скорость их роста в (млн·г^-1·сут^-1) как частное от деления числа микроорганизмов (в миллионах единиц) на массу питательной среды (в г) и время выращивания (в сут). Данные по скорости роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов для вышеуказанной питательной среды представлены в Таблице 1.

Пример 2

Выполняют как и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0006 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Бентонит 1.4 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая представлены в Таблице 1.

Пример 3

Осуществляют таким же образом, что и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.70 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.25 Хлорид натрия 0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.06 Молибдат натрия 0.0007 Сульфат железа(II) 0.004 Сахароза 22.0 Бентонит 1.8 Вода дистиллированная До 1 л

Результаты по определению скорости роста поименованных выше микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.

Пример 4 (сравнительный)

Проводят таким же образом, что и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов приготавливают питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Бентонит 0.7 Вода дистиллированная До 1 л

Сведения о скорости роста вышеуказанных микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.

Пример 5 (сравнительный)

Выполняют по общей схеме Примера 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Бентонит 2.5 Вода дистиллированная До 1 л

Показатели скорости роста микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.

Пример 6 (сравнительный)

Проводят таким же образом, что и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.50 Гидрофосфат калия 0.09 Сульфат магния гептагидрат 0.10 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.015 Молибдат натрия 0.0003 Сульфат железа(II) 0.001 Сахароза 14.0 Бентонит 1.4 Вода дистиллированная До 1 л

Показатели скорости роста микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.

Пример 7 (сравнительный)

Выполняют как и Пример 1, но выращивание консорциума вышеуказанных микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.90 Гидрофосфат калия 0.30 Сульфат магния гептагидрат 0.30 Хлорид натрия 0.35 Сульфат кальция дигидрат 0.09 Молибдат натрия 0.0010 Сульфат железа(II) 0.006 Сахароза 28.0 Бентонит 1.4 Вода дистиллированная До 1 л

Показатели скорости роста обоих этих микроорганизмов для данного случая даны в Таблице 1.

Пример 8 (сравнительный)

Проводят таким же образом, что и Пример 1, но для выращивания консорциума микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.50 Гидрофосфат калия 0.09 Сульфат магния гептагидрат 0.10 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.015 Молибдат натрия 0.0003 Сульфат железа(II) 0.001 Сахароза 14.0 Бентонит 2.5 Вода дистиллированная До 1 л

Значения скорости роста микроорганизмов для данного случая приведены в Таблице 1.

Пример 9 (сравнительный)

Выполняют как и Пример 1, но выращивание консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.90 Гидрофосфат калия 0.30 Сульфат магния гептагидрат 0.30 Хлорид натрия 0.35 Сульфат кальция дигидрат 0.09 Молибдат натрия 0.0010 Сульфат железа(II) 0.006 Сахароза 28.0 Бентонит 2.5 Вода дистиллированная До 1 л

Показатели скорости роста микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.

Пример 10 (по прототипу [3])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая показаны в Таблице 1.

Пример 11 (по аналогу [1])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Сульфат калия 0.20 Хлорид кальция гексагидрат 3.30 Фосфат натрия додекагидрат 3.80 Кукурузный экстракт 0.20 Глюкоза 10.0 Аспарагин 1.00 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая см. в Таблице 1.

Пример 12 (по аналогу [2])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.10 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Карбонат кальция 5.00 Сахароза 20.0 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для указанного случая также представлены в Таблице 1.

Таблица 1 №примера Содержание бентонита в питательной смеси, г/л Средняя скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов (Pseudomonas bras-sicacearum), млн·г^-1·сут^-1 Средняя скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов (Sphingobacterium multivorum), млн·г^-1·сут^-1 1 1.0 24 322 2 1.4 25 335 3 1.8 25 337 4 (сравнительный) 0.7 18 255 5 (сравнительный) 2.5 23 331 6 (сравнительный) 1.4 22 287 7 (сравнительный) 1.4 24 325 8 (сравнительный) 2.5 22 315 9 (сравнительный) 2.5 25 325 10 (по прототипу [3]) - 9 44 11 (по а налогу [1]) - 3 45 12 (по аналогу [2]) - 14 1.5

Как можно видеть из приведенных в Табл. 1 данных, использование заявляемой питательной среды, содержащей бентонит в количестве (1.0-1.8) г/л, позволяет весьма значительно увеличить скорости роста азотфиксирующих (Pseudomonas brassicacearum) и фосфатмобилизующих (Sphingobacterium multivorum) микроорганизмов в рамках их консорциума по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [3] и сред-аналогов [1] и [2]. При этом заявляемые нами количества бентонита в питательной смеси являются существенными: при увеличении его сверх указанного верхнего заявляемого значения (1.8 г/л) дальнейшего прироста скорости роста как тех, так и других микроорганизмов, уже не наблюдается (и даже происходит некоторое ее снижение), при уменьшении же ниже указанного нижнего заявляемого значения (1.0 г/л) имеет место снижение скорости роста.

Отметим в заключение, что аналогичные результаты были получены нами и на других культурах азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов (в частности, Azotobacter chroococcum, Регистрационный номер в ВКПМ В-103 87 и Achromobacter xylosoxidans, Регистрационный номер в ВКПМ В-10386).

ЛИТЕРАТУРА

[1] Основные микробиологические и биохимические методы исследования почвы (Методические рекомендации) / Под ред. Ю.М.Возняковской. - Л.: ВНИИСХМ, 1987. С.31.

[2] Руководство к практическим занятиям по микробиологии. 3-е издание переработанное, под ред. Н.С.Егорова. М.: Издательство Московского университета. 1995. С.204.

[3] Патент РФ 2.177.466 (2001), МПК С05М 1/08, C12N 1/20 (прототип).

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, бентонит и воду. Изобретение позволяет повысить скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов без изменения скорости роста азотфиксирующих микроорганизмов. 1 табл. 12 пр.

Питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидарт, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит бентонит при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
дигидрофосфат калия 0.60-0.70 гидрофосфат калия 0.12-0.20 сульфат магния гептагидрат 0.15-0.25 хлорид натрия 0.15-0.25 сульфат кальция дигидрат 0.02-0.06 молибдат натрия 0.0005-0.0007 сульфат железа(II) 0.002-0.004 сахароза 18.0-22.0 бентонит 1.0-1.8 вода дистиллированная до 1 л