ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КОНСОРЦИУМА ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ И АЗОТФИКСИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12R1/38 C12R1/01 

Изобретение относится к области создания биопрепаратов на основе индивидуальных микроорганизмов и их сочетаний (консорциумов) и может быть использовано в микробиологии и сельском хозяйстве.

Известна питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая глюкозу, аспарагин, сульфат калия, кукурузный экстракт, хлорид кальция, фосфат натрия и воду [1]. Недостатком этой питательной среды является относительно низкая скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста азотфиксирующих микроорганизмов, что делает ее малопригодной для выращивания их консорциума.

Известна питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, карбонат кальция, сахарозу и воду [2]. Недостатком этой питательной среды является практическое отсутствие на ней роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, что также делает ее малопригодной для выращивания их консорциума.

Известна также питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду, описанная в [3]. Недостатком данной питательной среды также является относительно низкая скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов.

Наиболее близким к заявляемому нами объекту по совокупности признаков и достигаемому техническому эффекту является питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, минеральную добавку - сапропель и воду, описанная в [4]. Недостатком данной питательной среды, которая в связи с только что отмеченным обстоятельством выбрана нами в качестве объекта-прототипа, также является относительно низкая скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов.

Цель данного изобретения - увеличение скорости роста фосфатмобилизующих микроорганизмов при культивировании консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, минеральную добавку и воду, в качестве минеральной добавки содержит наносапропель при следующем соотношении ингредиентов (г/л):

Дигидрофосфат калия 0.60-0.70 Гидрофосфат калия 0.12-0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.15-0.25 Хлорид натрия 0.15-0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.02-0.06 Молибдат натрия 0.0005-0.0007 Сульфат железа(II) 0.002-0.004 Сахароза 18.0-22.0 Наносапропель 0.5-1.5 Вода дистиллированная До 1 л

В результате использования данной питательной смеси скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов возрастает в 7-8 раз по сравнению с аналогичным показателем для питательной среды-прототипа [4].

До сих пор в литературе не описывалась питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая вышеуказанную совокупность ингредиентов вообще и наносапропель в частности; более того, применение последнего в составе питательных сред для микроорганизмов неизвестно вообще. Указанный факт позволяет нам сделать заключение о соответствии заявляемого нами объекта первому установленному патентным законодательством РФ критериальному признаку изобретения - новизна. Сопоставление же известных признаков питательной среды-прототипа [4] и отличительных признаков, характеризующих наш заявляемый объект (а именно введение в нее наносапропеля), априори не позволяет предсказать появления у него новых по сравнению с прототипом свойств, а именно указанного выше резкого увеличения скорости роста фосфатмобилизующих микроорганизмов (при одновременном снижении скорости роста азотфиксирующих микроорганизмов), входящих в состав консорциума. Указанный момент дает нам основания считать, что заявляемый объект явным образом не следует из известного в данной отрасли техники уровня; следовательно, он подпадает под второй из установленных законодательством РФ критериальных признаков изобретения - изобретательский уровень. Заявляемая нами питательная среда легко может быть получена в промышленном масштабе, а ее применение для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов не связано со сколько-нибудь серьезными техническими проблемами; в связи с этим мы вправе утверждать, что данному объекту присущ и третий установленный законодательством РФ критериальный признак изобретения, а именно промышленная применимость.

Заявляемая на предмет изобретения питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов может быть продемонстрирована на следующих примерах.

Пример 1

Природный сапропель из месторождения близ озера Белое (Тукаевский район Республики Татарстан) измельчают в муку и смешивают с дистиллированной или деионизированной (обессоленной) водой из расчета 20 г сапропеля на 100 мл воды. Полученную смесь обрабатывают ультразвуком в ультразвуковом диспергаторе УЗУ-0,25 мощностью 80 Вт при частоте 18.5 кГц с амплитудой колебаний ультразвукового волновода 5 мкм в течение (5-20) мин при комнатной температуре, в результате чего получается водно-сапропелевая суспензия с размерами частиц сапропеля от 5 до 100 нм. Приготовленную таким образом суспензию наносапропеля далее используют в качестве одного из компонентов питательной среды для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов.

Пример 2

Приготавливают питательную среду для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.60 Гидрофосфат калия 0.12 Сульфат магния гептагидрат 0.15 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.02 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.002 Сахароза 18.0 Наносапропель 0.5 Вода дистиллированная До 1 л

Составляют консорциум фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов с соотношение 1:1 по количеству колониеобразующих единиц на основе коллекционных (депонированных) штаммов поименованных микроорганизмов (Sphingobacterium multivorum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10385) и (Pseudomonas brassicacearum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10388) соответственно. Для этого предварительно выращивают фосфатмобилизующие микроорганизмы на агаризованной среде Муромцева, азотфиксирующие - на агаризованной среде Эшби; далее эти культуры высеваются на питательную среду указанного выше состава. Выращивание ведут в течение того периода времени, в котором имеет место прирост их численности (4.5 сут), после чего этот процесс прекращают. Для определения численности микроорганизмов сразу же проводят посев консорциума на ага-ризованные питательные среды (среда Муромцева в случае фосфатмобилизующих микроорганизмов и среда Эшби в случае азотфиксирующих) и определяют среднюю скорость их роста в (млн·г^-1·сут^-1) как частное от деления числа микроорганизмов (в миллионах единиц) на массу питательной среды (в г) и время выращивания (в сут). Данные по скорости роста фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов для вышеуказанной питательной среды представлены в Таблице 1.

Пример 3

Осуществляют, как и Пример 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов берут питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0006 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Наносапропель 1.0 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая представлены в Таблице 1.

Пример 4

Выполняют, как и Пример 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов берут питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.70 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.25 Хлорид натрия 0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.06 Молибдат натрия 0.0007 Сульфат железа(II) 0.004 Сахароза 22.0 Наносапропель 1.5 Вода дистиллированная До 1 л

Сведения о скорости роста указанных микроорганизмов для данного случая приведены в Таблице 1.

Пример 5 (сравнительный)

Проводят таким же образом, что и Пример 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов приготавливают питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Наносапропель 0.3 Вода дистиллированная До 1 л

Сведения о скорости роста вышеуказанных микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.

Пример 6 (сравнительный)

Выполняют по общей схеме Примера 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Наносапропель 2.0 Вода дистиллированная До 1 л

Показатели скорости роста микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.

Пример 7 (сравнительный)

Проводят таким же образом, что и Пример 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.50 Гидрофосфат калия 0.09 Сульфат магния гептагидрат 0.10 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.015 Молибдат натрия 0.0003 Сульфат железа(II) 0.001 Сахароза 14.0 Наносапропель 1.0 Вода дистиллированная До 1 л

Показатели скорости роста микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.

Пример 8 (сравнительный)

Проводят по общей схеме Примера 2, но культивирование консорциума вышеуказанных микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.90 Гидрофосфат калия 0.30 Сульфат магния гептагидрат 0.30 Хлорид натрия 0.35 Сульфат кальция дигидрат 0.09 Молибдат натрия 0.0010 Сульфат железа(II) 0.006 Сахароза 28.0 Наносапропель 1.0 Вода дистиллированная До 1 л

Сведения о скорости роста микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.

Пример 9 (сравнительный)

Выполняют таким же образом, как и Пример 2, но для культивирования консорциума микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.50 Гидрофосфат калия 0.09 Сульфат магния гептагидрат 0.10 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.015 Молибдат натрия 0.0003 Сульфат железа(II) 0.001 Сахароза 14.0 Наносапропель 2.0 Вода дистиллированная До 1 л

Значения скорости роста микроорганизмов для данного случая приведены в Таблице 1.

Пример 10 (сравнительный)

Выполняют по той же общей схеме, что и Пример 2, но культивирование консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.90 Гидрофосфат калия 0.30 Сульфат магния гептагидрат 0.30 Хлорид натрия 0.35 Сульфат кальция дигидрат 0.09 Молибдат натрия 0.0010 Сульфат железа(II) 0.006 Сахароза 28.0 Наносапропель 2.5 Вода дистиллированная До 1 л

Показатели скорости роста микроорганизмов для этого случая даны в Таблице 1.

Пример 11 (по прототипу [4])

Выполняют по той же общей схеме, что и Пример 2, но культивирование консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0006 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Сапропель 1.0 Вода дистиллированная До 1 л

Показатели скорости роста микроорганизмов для этого случая даны в Таблице 1.

Пример 12 (по прототипу [4])

Выполняют по той же общей схеме, что и Пример 2, но культивирование консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.70 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.25 Хлорид натрия 0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.06 Молибдат натрия 0.0007 Сульфат железа(II) 0.004 Сахароза 22.0 Сапропель 1.5 Вода дистиллированная До 1 л

Показатели скорости роста микроорганизмов для этого случая даны в Таблице 1.

Пример 13 (по аналогу [3])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для такого случая см. в Таблице 1.

Пример 14 (по аналогу [1])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Сульфат калия 0.20 Хлорид кальция гексагидрат 3.30 Фосфат натрия додекагидрат 3.80 Кукурузный экстракт 0.20 Глюкоза 10.0 Аспарагин 1.00 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая приведены в Таблице 1.

Пример 15 (по аналогу [2])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.10 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Карбонат кальция 5.00 Сахароза 20.0 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая также см. в Таблице 1.

Таблица 1 № примера Содержание нано-сапропеля в питательной смеси, г/л Средняя скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов {Sphingobacterium multivorum), млн·г^-1·сут^-1 Средняя скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов (Pseudomonas brassicacearum), млн·г^-1·сут^-1 2 0.5 373.3 4.7 3 1.0 391.1 4.9 4 1.5 382.2 4.9 5 (сравнительный) 0.3 284.4 6.7 6 (сравнительный) 2.0 311.1 5.3 7 (сравнительный) 1.0 351.1 7.1 8 (сравнительный) 1.0 344.4 6.7 9 (сравнительный) 2.0 337.8 5.8 10 (сравнительный) 2.0 328.9 5.3 11 (по прототипу [4]) - 46.7 15.1 12 (по прототипу [4]) - 47.1 14.9 13 (по аналогу [3]) - 38.9 8.0 14 (по аналогу [1]) - 40.0 2.7 15 (по аналогу [2]) - 1.3 12.5

Как можно видеть из приведенных в Таблице 1 данных, использование заявляемой питательной среды, содержащей наносапропель в количестве (0.5-1.5) г/л, позволяет значительно (в 7-8 раз) повысить скорость роста фосфатмобилизующих (Sphingobacterium multivorum) микроорганизмов при снижении скорости роста азотфиксирующих (Pseudomonas brassicacearum} микроорганизмов в рамках их консорциума по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [4] (и в еще большей степени по сравнению со средами-аналогами [1], [2] и [3]). При этом заявляемые нами количества наносапропеля в питательной смеси являются существенными: при увеличении его сверхуказанного верхнего заявляемого предела (1.5 г/л) дальнейшего прироста скорости роста фосфатмобилизующих микроорганизмов уже не происходит, при уменьшении же нижеуказанного нижнего заявляемого значения (1.0 г/л) отмечается снижение скорости их роста (хотя она и остается значительно большей по сравнению с той, что имеет место на питательной среде [4]).

Аналогичные вышеуказанным результаты были получены нами и на других культурах азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов (в частности, Azotobacter chroococcum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10387 и Achromobacter xylosoxidans, Регистрационный номер в ВКПМ В-10386).

ЛИТЕРАТУРА

[1] Основные микробиологические и биохимические методы исследования почвы (Методические рекомендации) / Под ред. Ю.М. Возняковской. - Л.: ВНИИСХМ, 1987. С.31.

[2] Руководство к практическим занятиям по микробиологии. 3-е издание переработанное, под ред. Н.С. Егорова. М: Издательство Московского университета. 1995. С.204.

[3] Патент РФ 2.177.466 (2001), МПК C05F 11/08, C12N 1/20.

[4] Заявка на изобретение РФ №2012145906 от 26.10.2012, МПК C12N 1/00, C12N 1/20, C12N 1/22 (прототип).

Изобретение относится биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, наносапропель и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить скорость роста фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов. 1 табл., 15 пр.

Питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, минеральную добавку и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве минеральной добавки она содержит наносапропель при следующем соотношении компонентов, г/л:
дигидрофосфат калия 0.60-0.70 гидрофосфат калия 0.12-0.20 сульфат магния гептагидрат 0.15-0.25 хлорид натрия 0.15-0.25 сульфат кальция дигидрат 0.02-0.06 молибдат натрия 0.0005-0.0007 сульфат железа(II) 0.002-0.004 сахароза 18.0-22.0 наносапропель 0.5-1.5 вода дистиллированная до 1 л