ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КОНСОРЦИУМА АЗОТФИКСИРУЮЩИХ И ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 C05F11/08 

Изобретение относится к области создания биопрепаратов на основе индивидуальных микроорганизмов и их сочетаний (консорциумов) и может быть использовано в микробиологии и сельском хозяйстве.

Известна питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая глюкозу, аспарагин, сульфат калия, кукурузный экстракт, хлорид кальция, фосфат натрия и воду [1]. Недостатком данной питательной среды является относительно низкая скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста азотфиксирующих микроорганизмов, вследствие чего она малопригодна для выращивания их консорциума.

Известна питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, карбонат кальция, сахарозу и воду [2]. Недостатком данной питательной среды является относительно низкая скорость роста на ней азотфиксирующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, вследствие чего она также малопригодна для выращивания их консорциума.

Наиболее близким к заявляемому нами объекту по совокупности признаков и достигаемому техническому эффекту является питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду (т.н. среда Берка), описанная в [3]. Недостатком данной питательной среды, которая в связи с указанным обстоятельством взята нами за прототип, также является сравнительно низкая скорость роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов, и, следовательно, их консорциума в целом.

Цель настоящего изобретения - увеличение скорости роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов на питательной среде при выращивании консорциума на их основе.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II) и воду, дополнительно содержит фосфорит при следующем соотношении компонентов (г/л):

Дигидрофосфат калия 0.60-0.70 Гидрофосфат калия 0.12-0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.15-0.25 Хлорид натрия 0.15-0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.02-0.06 Молибдат натрия 0.0005-0.0007 Сульфат железа(II) 0.002-0.004 Сахароза 18.0-22.0 Фосфорит 1.0-1.5 Вода дистиллированная До 1 л

В результате использования данной питательной смеси скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов возрастает более чем в 15 раз, фосфатмобилизующих - почти на порядок по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [3].

До настоящего времени в литературе не была кем-либо описана питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая вышеуказанную совокупность ингредиентов вообще и фосфорит в частности. Это обстоятельство дает нам основание считать, что заявляемый нами объект соответствует первому критериальному признаку изобретения по патентному законодательству РФ - новизна. С другой стороны, сопоставление известных признаков питательной среды-прототипа [3] и отличительных признаков заявляемой нами питательной среды (а именно введение в нее фосфорита) не позволяют предсказать априори появления у нее новых по сравнению с прототипом свойств, а именно указанного выше резкого увеличения скорости роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов в рамках вышеуказанного консорциума (в обоих случаях - на порядок и более). Указанное обстоятельство дает нам право утверждать, что заявляемый объект явным образом не следует из известного в данной отрасли техники уровня; следовательно, налицо его соответствие второму критериальному признаку изобретения по патентному законодательству РФ - изобретательский уровень. Предлагаемая нами питательная среда достаточно без особого труда может быть создана в промышленном масштабе и ее применение для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов осуществимо без каких-либо проблем, в связи с чем есть все основания утверждать: заявляемому нами объекту присущ и третий установленный патентным законодательством РФ критериальный признак изобретения, а именно промышленная применимость.

Заявляемая на предмет изобретения питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов может быть проиллюстрирована нижеследующими примерами.

Пример 1

Приготавливают питательную среду для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.60 Гидрофосфат калия 0.12 Сульфат магния гептагидрат 0.15 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.02 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.002 Сахароза 18.0 Фосфорит 1.0 Вода дистиллированная До 1 л

Составляют консорциум азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов на основе коллекционных (депонированных) штаммов поименованных микроорганизмов (Pseudomonas brassicacearum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10388) и (Sphingobacterium multivorum. Регистрационный номер в ВКПМ В-10385), соответственно, с соотношением 1:1 по количеству КОЕ (колониеобразующих единиц). Для этого предварительно выращивают азотфиксирующие микроорганизмы на агаризованной среде Эшби, а фосфатмобилизующие - на агаризованной среде Муромцева, после чего обе эти культуры высеваются на питательную среду указанного выше состава. Выращивание ведут в течение того периода времени, в котором имеет место прирост их численности (5.0 сут), после чего этот процесс прекращают. Для определения численности микроорганизмов сразу же проводят посев консорциума на агаризованные питательные среды (среда Эшби в случае азотфиксирующих и среда Муромцева в случае фосфатмобилизирующих) и определяют среднюю скорость их роста в (млн·г^-1·сут^-1) как частное от деления числа микроорганизмов (в миллионах единиц) на массу питательной среды (в г) и время выращивания (в сут). Данные по скорости роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов для вышеуказанной питательной среды представлены в Таблице 1.

ПРИМЕР 2

Выполняют, как и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0006 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Фосфорит 1.2 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая представлены в Таблице 1.

Пример 3

Проводят таким же образом, как и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.70 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.25 Хлорид натрия 0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.06 Молибдат натрия 0.0007 Сульфат железа(II) 0.004 Сахароза 22.0 Фосфорит 1.5 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по определению скорости роста поименовавнных выше микроорганизмов для указанного случая приведены в Таблице 1.

Пример 4 (сравнительный)

Осуществляют по типу примера 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов приготавливают питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Фосфорит 0.8 Вода дистиллированная До 1 л

Показатели скорости роста вышеуказанных микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.

Пример 5 (сравнительный)

Выполняют подобно примеру 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Фосфорит 1.8 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по определению скорости роста микроорганизмов для этого случая приведены в Таблице 1.

Пример 6 (сравнительный)

Выполняют по той же общей технологии, что и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.50 Гидрофосфат калия 0.09 Сульфат магния гептагидрат 0.10 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.015 Молибдат натрия 0.0003 Сульфат железа(II) 0.001 Сахароза 14.0 Фосфорит 1.2 Вода дистиллированная До 1 л

Результаты по определению скорости роста микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.

Пример 7 (сравнительный)

Проводят, как и пример 1, но выращивание консорциума вышеуказанных микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.90 Гидрофосфат калия 0.30 Сульфат магния гептагидрат 0.30 Хлорид натрия 0.35 Сульфат кальция дигидрат 0.09 Молибдат натрия 0.0010 Сульфат железа(II) 0.006 Сахароза 28.0 Фосфорит 1.2 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по скорости роста обоих этих микроорганизмов для указанного случая представлены в Таблице 1.

Пример 8 (сравнительный)

Осуществляют, как и пример 1, но для выращивания консорциума микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.50 Гидрофосфат калия 0.09 Сульфат магния гептагидрат 0.10 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.015 Молибдат натрия 0.0003 Сульфат железа(II) 0.001 Сахароза 14.0 Фосфорит 1.8 Вода дистиллированная До 1 л

Значения скорости роста микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.

Пример 9 (сравнительный)

Осуществляют, применяя описанную в примере 1 общую схему, но выращивание консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.90 Гидрофосфат калия 0.30 Сульфат магния гептагидрат 0.30 Хлорид натрия 0.35 Сульфат кальция дигидрат 0.09 Молибдат натрия 0.0010 Сульфат железа(II) 0.006 Сахароза 28.0 Фосфорит 1.8 Вода дистиллированная До 1 л

Значения скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая приведены в Таблице 1.

Пример 10 (по прототипу [3])

Выполняют по той же технологической схеме, что и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Вода дистиллированная До 1 л

Данные о скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая см. в Таблице 1.

Пример 11 (по аналогу [1])

Осуществляют таким же образом, как и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Сульфат калия 0.20 Хлорид кальция гексагидрат 3.30 Фосфат натрия додекагидрат 3.80 Кукурузный экстракт 0.20 Глюкоза 10.0 Аспарагин 1.00 Вода дистиллированная До 1 л

Сведения о скорости роста микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.

Пример 12 (по аналогу [2])

Выполняют по той же технологической схеме, что и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.10 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Карбонат кальция 5.00 Сахароза 20.0 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая также представлены в Таблице 1.

Таблица 1 № примера Содержание фосфорита в питательной смеси, г/л Средняя скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов (Pseudomonas brassicacearum), млн·г^-1·сут^-1 Средняя скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов {Sphingobacterium multivorum), млн·г^-1·сут^-1 1 1.0 600/5 1750/5 2 1.2 620/5 1780/5 3 1.5 610/5 1730/5 4 (сравнительный) 0.8 490/5 1520/5 5 (сравнительный) 1.8 600/5 1690/5 6 (сравнительный) 1.2 540/5 1650/5 7 (сравнительный) 1.2 590/5 1700/5 8 (сравнительный) 1.8 550/5 1620/5 9 (сравнительный) 1.8 570/5 1660/5 10 (по прототипу) - 36/5 175/5 11 (по аналогу [1]) - 12/5 180/5 12 (по аналогу [2]) - 55/5 6/5

Как можно видеть из приведенных в Таблице 1 данных, применение заявляемой питательной среды, содержащей фосфорит в количестве (1.0-1.5) г/л, позволяет резко увеличить скорости роста азотфиксирующих (Pseudomonas brassicacearum) и фосфатмобилизующих (Sphingobacterium multivorum) микроорганизмов в рамках их консорциума по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [3] и сред-аналогов [1] и [2]. Заявляемые нами количества фосфорита в питательной смеси являются существенными: увеличение этого количества сверх указанного верхнего заявляемого значения (1.5 г/л) не приводит к дальнейшему возрастанию скорости роста как тех, так и других микроорганизмов и даже происходит некоторое ее снижение, при уменьшении же ниже указанного нижнего заявляемого значения (1.0 г/л) имеет место снижение скорости роста.

Аналогичные результаты были зафиксированы нами и на других культурах азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов (в частности, Azotobacter chroococcum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10387 и Achromobacter xylosoxidans, Регистрационный номер в ВКПМ В-10386).

ЛИТЕРАТУРА

[1] Основные микробиологические и биохимические методы исследования почвы (Методические рекомендации) / Под ред. Ю.М.Возняковской. - Л.: ВНИИСХМ, 1987. С.31.

[2] Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 3-е издание переработанное, под ред. Н.С.Егорова. М: Издательство Московского университета. 1995. - С.204.

[3] Патент РФ 2.177.466 (2001), МПК C05F 11/08, C12N 1/20 (прототип).

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, фосфорит и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет увеличить скорость роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов. 1 табл., 12 пр.

1. Питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит фосфорит при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
Дигидрофосфат калия 0.60-0.70 Гидрофосфат калия 0.12-0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.15-0.25 Хлорид натрия 0.15-0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.02-0.06 Молибдат натрия 0.0005-0.0007 Сульфат железа(II) 0.002-0.004 Сахароза 18.0-22.0 Фосфорит 1.0-1.5 Вода дистиллированная До 1 л