ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КОНСОРЦИУМА ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ И АЗОТФИКСИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12R1/38 C12R1/01 

Изобретение относится к области создания биопрепаратов на основе индивидуальных микроорганизмов и их сочетаний (консорциумов) и может быть использовано в микробиологии и сельском хозяйстве.

Известна питательная среда для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, карбонат кальция, сахарозу и воду [1]. Недостатком данной питательной среды является относительно низкая скорость роста на ней азотфиксирующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, что также делает ее малопригодной для выращивания их консорциума.

Известна также питательная среда для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду (т.н. среда Берка) [2]. Недостатком данной питательной среды также является сравнительно низкая скорость роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов, и, следовательно, их консорциума в целом.

Наиболее близким к заявляемому нами объекту по совокупности признаков и достигаемому техническому эффекту является питательная среда для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, минеральную добавку - бентонит и воду [3]. Недостатком данной питательной среды, которая в связи с только что отмеченным обстоятельством выбрана нами в качестве объекта-прототипа, также является сравнительно низкая скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов.

Цель настоящего изобретения - увеличение скорости роста фосфатмобилизующих микроорганизмов на питательной среде при сохранении практически неизменной скорости роста азотфиксирующих микроорганизмов в процессе выращивания консорциума на их основе.

Декларируемая цель достигается тем, что в питательной среде для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащую дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа (II), сахарозу, минеральную добавку и воду, в качестве минеральной добавки используется нанобентонит при следующем соотношении ингредиентов (г/л):

Дигидрофосфат калия 0.60-0.70 Гидрофосфат калия 0.12-0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.15-0.25 Хлорид натрия 0.15-0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.02-0.06 Молибдат натрия 0.0005-0.0007 Сульфат железа(II) 0.002-0.004 Сахароза 18.0-22.0 Нанобентонит 0.7-1.5 Вода дистиллированная До 1 л

При использовании такой питательной смеси скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов возрастает на 25-30% по сравнению с таковой для питательной среды-прототипа [3], скорость же роста азотфиксирующих микроорганизмов остается практически неизменной.

До настоящего времени в литературе не описана питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая вышеуказанную совокупность ингредиентов и нанобентонит в частности; более того, применение нанобентонита в составе питательных сред для выращивания микроорганизмов неизвестно вообще. Это обстоятельство дает нам основание считать, что заявляемый нами объект соответствует первому критериальному признаку изобретения, установленному патентным законодательством РФ, - новизна. Сопоставление известных признаков питательной среды-прототипа [3] и отличительных признаков, характеризующих заявляемый нами объект (а именно - замена содержащегося в питательной среде-прототипе бентонита на нанобентонит), не позволяет предсказать априори появления у него новых по сравнению с прототипом свойств, а именно указанного выше увеличения скорости роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, входящих в состав вышеуказанного консорциума, при сохранении практически неизменной скорости роста азотфиксирующих. Данный факт позволяет сделать заключение, что заявляемый нами объект явным образом не следует из известного в данной отрасли техники уровня, а значит, соответствует второму установленному законодательством РФ критериальному признаку изобретения - изобретательский уровень. И, наконец, предлагаемая нами питательная среда достаточно легко может быть получена в промышленном масштабе и ее применение для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов осуществимо без каких-либо проблем, так что заявляемому нами объекту присущ и третий установленный законодательством РФ критериальный признак изобретения - промышленная применимость.

Использование заявляемой на предмет изобретения питательной среды для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1

(приготовление нанобентонита)

Природный бентонит из Тарн-Варского месторождения (Нурлатский район Республики Татарстан) измельчают в муку и смешивают с дистиллированной или деионизированной (обессоленной) водой из расчета 20 г бентонита на 100 мл воды. Полученную смесь обрабатывают ультразвуком в ультразвуковом диспергаторе УЗУ-0,25 мощностью 80 Вт при частоте 18.5 кГц с амплитудой колебаний ультразвукового волновода 5 мкм в течение (5-20) мин при комнатной температуре, в результате чего получается водно-бентонитовая суспензия с размерами частиц бентонита от 5 до 100 нм. Приготовленную таким образом суспензию нанобентонита далее используют в качестве одного из компонентов питательной среды для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов.

Пример 2

Приготавливают питательную среду для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.60 Гидрофосфат калия 0.12 Сульфат магния гептагидрат 0.15 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.02 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.002 Сахароза 18.0 Нанобентонит 0.7 Вода дистиллированная До 1 л

Составляют консорциум фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов с соотношением 1:1 по количеству колониеобразующих единиц на основе коллекционных (депонированных) штаммов поименованных микроорганизмов (Sphingo bacteriummultivorum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10385) и (Pseudomonas brassicacearum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10388) соответственно. Для этого предварительно выращивают азотфиксирующие микроорганизмы на агаризованной среде Эшби, а фосфатмобилизующие - на агаризованной среде Муромцева, после чего обе эти культуры высеваются на питательную среду указанного выше состава. Выращивание ведут в течение того периода времени, в котором имеет место прирост их численности (4 сут.), после чего этот процесс прекращают. Для определения численности микроорганизмов сразу же проводят посев консорциума на агаризованные питательные среды (среда Эшби в случае азотфиксирующих и среда Муромцева - в случае фосфатмобилизующих) и определяют среднюю скорость их роста в (млнт^-1·сут^-1) как частное от деления числа микроорганизмов (в миллионах единиц) на массу питательной среды (в г) и время выращивания (в сут). Сведения о скорости роста фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов для вышеуказанной питательной среды представлены в Таблице 1.

Пример 3

Проводят, как и Пример 2, но для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0006 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Нанобентонит 1.0 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая приведены в Таблице 1.

Пример 4

Осуществляют таким же образом, что и Пример 2, но для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.70 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.25 Хлорид натрия 0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.06 Молибдат натрия 0.0007 Сульфат железа(II) 0.004 Сахароза 22.0 Нанобентонит 1.5 Вода дистиллированная До 1 л

Результаты по определению скорости роста поименованных выше микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.

Пример 5

(сравнительный)

Проводят таким же образом, что и Пример 2, но для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов приготавливают питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Нанобентонит 0.4 Вода дистиллированная До 1 л

Показатели скорости роста вышеуказанных микроорганизмов для данного случая даны в Таблице 1.

Пример 6

(сравнительный)

Выполняют по общей схеме Примера 2, но для выращивания консорциума фосфат-мобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Нанобентонит 2.0 Вода дистиллированная До 1 л

Данные о скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая представлены в Таблице 1.

Пример 7

(сравнительный)

Проводят таким же образом, что и Пример 2, но для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.50 Гидрофосфат калия 0.09 Сульфат магния гептагидрат 0.10 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.015 Молибдат натрия 0.0003 Сульфат железа(II) 0.001 Сахароза 14.0 Нанобентонит 1.2 Вода дистиллированная До 1 л

Сведения о скорости роста микроорганизмов для данного случая показаны в Таблице 1.

Пример 8

(сравнительный)

Выполняют, как и Пример 2, но выращивания консорциума вышеуказанных микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.90 Гидрофосфат калия 0.30 Сульфат магния гептагидрат 0.30 Хлорид натрия 0.35 Сульфат кальция дигидрат 0.09 Молибдат натрия 0.0010 Сульфат железа(II) 0.006 Сахароза 28.0 Нанобентонит 1.2 Вода дистиллированная До 1 л

Показатели скорости роста каждого из вышеуказанных типов микроорганизмов для данного случая даны в Таблице 1.

Пример 9

(сравнительный)

Проводят таким же образом, что и Пример 2, но для выращивания консорциума микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.50 Гидрофосфат калия 0.09 Сульфат магния гептагидрат 0.10 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.015 Молибдат натрия 0.0003 Сульфат железа(II) 0.001 Сахароза 14.0 Нанобентонит 2.0 Вода дистиллированная До 1 л

Значения скорости роста микроорганизмов для данного случая приведены в Таблице 1.

Пример 10

(сравнительный)

Выполняют как и Пример 2, но выращивание консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.90 Гидрофосфат калия 0.30 Сульфат магния гептагидрат 0.30 Хлорид натрия 0.35 Сульфат кальция дигидрат 0.09 Молибдат натрия 0.0010 Сульфат железа(II) 0.006 Сахароза 28.0 Нанобентонит 2.0 Вода дистиллированная До 1 л

Показатели скорости роста микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.

Пример 11

(по прототипу [3])

Проводят по той же технологической схеме, что и Пример 2, но для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0006 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Бентонит 1.4 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая приведены в Таблице 1.

Пример 12

(по прототипу [3])

Осуществляют таким же образом, что и Пример 2, но для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов берут питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.70 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.25 Хлорид натрия 0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.06 Молибдат натрия 0.0007 Сульфат железа(II) 0.004 Сахароза 22.0 Бентонит 1.8 Вода дистиллированная До 1 л

Результаты по определению скорости роста поименованных выше микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.

Пример 13

(по аналогу [2])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 2, но для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16   Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Вода дистиллированная До 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая показаны в Таблице 1.

Пример 14

(по аналогу [1])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 1, но для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов берут питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.10 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Карбонат кальция 5.00   Сахароза 20.0 Вода дистиллированная до 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для указанного случая также представлены в Таблице 1.

Таблица 1 № примера Содержание нанобентонита в питательной смеси, г/л Средняя скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов Sphingobacterium multivorum, млнт^-1·сут^-1 Средняя скорость
роста азотфиксирующих микроорганизмов Pseudomonas brassicacearum, млнт^-1·сут^-1 2 0.7 395.0 22.0 3 1.0 413.0 24.0 4 1.5 405.5 22.5 5 (сравнительный) 0.4 360.0 23.0 6 (сравнительный) 2.0 375.0 21.0 7 (сравнительный) 1.2 362.5 22.0 8 (сравнительный) 1.2 370.0 21.5 9 (сравнительный) 2.0 340.0 21.0 10 (сравнительный) 2.0 357.5 22.5 11 (по прототипу [3]) - 320.0 24.0 12 (по прототипу [3]) - 332.5 24.5 13 (по аналогу [2]) - 49.0 9.0 14 (по аналогу [1]) - 1.5 14.0

Как можно видеть из приведенных в Таблице 1 данных, использование заявляемой питательной среды, содержащей нанобентонит в количестве (0.7-1.5) г/л, позволяет примерно на 25-30% увеличить скорости роста фосфатмобилизующих (Sphingobacterium multivorum) микроорганизмов и сохранить практически неизменной скорость роста азотфиксирующих (Pseudomonas brassicacearum) микроорганизмов в рамках их консорциума по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [3] и сред-аналогов [1] и [2]. При этом заявляемые нами количества нанобентонита в питательной смеси являются существенными: при увеличении его сверх указанного верхнего заявляемого предела дальнейшего прироста скорости роста как тех, так и других микроорганизмов уже не наблюдается (и даже происходит некоторое ее снижение), при уменьшении же ниже указанного нижнего заявляемого предела имеет место снижение скорости роста.

Отметим в заключение, что аналогичные результаты были получены нами и на других культурах азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов (в частности, Azotobacter chroococcum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10387 и Achromobacter xylosoxidans, Регистрационный номер в ВКПМ В-10386).

ЛИТЕРАТУРА

[1] Руководство к практическим занятиям по микробиологии. 3-е издание переработанное, под ред. Н.С.Егорова. М.: Издательство Московского университета. 1995. С.204.

[2] Патент РФ 2.177.466 (2001), МПК C05F 11/08, C12N 1/20.

[3] Заявка на изобретение РФ №2012145904 от 26.10.2012, МПК C12N 1/00, C12N 1/20, C12N 1/22 (прототип).

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, нанобентонит и дистиллированную воду. Изобретение позволяет повысить скорость роста фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов. 1 табл., 14 пр.

Питательная среда для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, минеральную добавку и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве минеральной добавки она содержит нанобентонит при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
дигидрофосфат калия 0,60-0,70 гидрофосфат калия 0,12-0,20 сульфат магния гептагидрат 0,15-0,25 хлорид натрия 0,15-0,25 сульфат кальция дигидрат 0,02-0,06 молибдат натрия 0,0005-0,0007 сульфат железа(II) 0,002-0,004 сахароза 18,0-22,0 нанобентонит 0,7-1,5 вода дистиллированная до 1 л