ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КОНСОРЦИУМА АЗОТФИКСИРУЮЩИХ И ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12R1/38 C12R1/01 

Изобретение относится к области создания биопрепаратов на основе индивидуальных микроорганизмов и их сочетаний (консорциумов) и может быть использовано в микробиологии и сельском хозяйстве.

Известна питательная среда для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, карбонат кальция, сахарозу и воду [1]. Недостатком данной питательной среды является относительно низкая скорость роста на ней азотфиксирующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, что также делает ее малопригодной для выращивания их консорциума.

Известна также питательная среда для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду (т.н. среда Берка) [2]. Недостатком данной питательной среды также является сравнительно низкая скорость роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов, и, следовательно, их консорциума в целом.

Наиболее близким к заявляемому объекту по совокупности признаков и достигаемому техническому эффекту является питательная среда для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, минеральную добавку - вермикулит и воду [3]. Недостатком данной питательной среды, которая в связи с только что отмеченным обстоятельством выбрана в качестве объекта-прототипа, также является сравнительно низкая скорость роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов.

Цель настоящего изобретения - увеличение скорости роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов на питательной среде в процессе культивирования консорциума на их основе.

Декларируемая цель достигается тем, что в питательной среде для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащую дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, минеральную добавку и воду, в качестве минеральной добавки используется нановермикулит при следующем соотношении ингредиентов (г/л):

Дигидрофосфат калия 0.60-0.70 Гидрофосфат калия 0.12-0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.15-0.25 Хлорид натрия 0.15-0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.02-0.06 Молибдат натрия 0.0005-0.0007 Сульфат железа(II) 0.002-0.004 Сахароза 18.0-22.0 Нановермикулит 0.6-1.3 Вода дистиллированная до 1 л

В результате использования данной питательной смеси скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов повышается в 1.5-2.0 раза по сравнению с таковой для питательной среды-прототипа [3]; скорость же роста фосфатмобилизующих микроорганизмов возрастает на 30-40%.

До настоящего времени в литературе не была кем-либо описана питательная среда для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая вышеуказанную совокупность ингредиентов вообще и нановермикулит в частности; более того, и само применение последнего в составе питательных сред для выращивания микроорганизмов неизвестно вообще. Данное обстоятельство позволяет сделать заключение о том, что заявляемый объект соответствует первому из установленных патентным законодательством РФ критериальных признаков изобретения «новизна». Сопоставление известных признаков питательной среды-прототипа [3] и отличительных признаков, характеризующих заявляемый объект (а именно - замена содержащегося в питательной среде-прототипе вермикулита на нановермикулит), не позволяет предсказать априори появления у него новых по сравнению с прототипом свойств, а именно указанного выше увеличения скорости роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов, входящих в состав вышеуказанного консорциума (причем - в разной степени). Отмеченный факт, по нашему мнению, свидетельствует о том, что заявляемый объект явным образом не следует из известного в данной отрасли техники уровня и тем самым соответствует второму из установленных законодательством РФ критериальных признаков изобретения «изобретательский уровень». Предлагаемая питательная среда достаточно легко может быть получена в промышленном масштабе, ее применение для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов не требует какого-либо специального и дорогостоящего оборудования, энергозатрат и т.п.; в связи с этим несомненно, что заявляемый объект соответствует и третьему из установленных законодательством РФ критериальных признаков изобретения «промышленная применимость».

Заявляемая на предмет изобретения питательная среда для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1 (приготовление нанобентонита)

Природный вермикулит, добытый из Татарского месторождения (Красноярский край, РФ), измельчают в муку и смешивают с дистиллированной или деионизированной (обессоленной) водой из расчета 20 г вермикулита на 100 мл воды. Полученную смесь обрабатывают ультразвуком в ультразвуковом диспергаторе УЗУ-0,25 мощностью 80 Вт при частоте 18.5 кГц с амплитудой колебаний ультразвукового волновода 5 мкм в течение (5-20) мин при комнатной температуре, в результате чего получается водно-вермикулитовая суспензия с размерами частиц вермикулита от 5 до 100 нм. Приготовленную таким образом суспензию нановермикулита далее используют в качестве одного из компонентов питательной среды для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов.

Приготавливают питательную среду для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов состава, г/л:

Пример 2

Дигидрофосфат калия 0.60 Гидрофосфат калия 0.12 Сульфат магния гептагидрат 0.15 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.02 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.002 Сахароза 18.0 Нановермикулит 0.6 Вода дистиллированная до 1 л

Составляют консорциум азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов с соотношением 1:1 по количеству колониеобразующих единиц на основе коллекционных (депонированных) штаммов поименованных микроорганизмов (Pseudomonas brassicacearum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10388) и (Sphingobacterium multivorum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10385) соответственно. Для этого предварительно выращивают азотфиксирующие микроорганизмы на агаризованной среде Эшби, а фосфатмобилизующие - на агаризованной среде Муромцева, после чего обе эти культуры высеваются на питательную среду указанного выше состава. Выращивание ведут в течение того периода времени, в котором имеет место прирост их численности (5.5 сут), после чего этот процесс прекращают. Для определения численности микроорганизмов сразу же проводят посев консорциума на агаризованные питательные среды (среда Эшби в случае азотфиксирующих и среда Муромцева в случае фосфатмобилизующих) и определяют среднюю скорость их роста в (млнт^-1·сут^-1) как частное от деления числа микроорганизмов (в миллионах единиц) на массу питательной среды (в г) и время выращивания (в сут.). Итоговые результаты по определению скорости роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов для вышеуказанной питательной среды представлены в Таблице 1.

Пример 3

Выполняют по общей технологической схеме Примера 2, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0006 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Нановермикулит до 1.0

Вода дистиллированная до 1 л

Результаты по определению скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая приведены в Таблице 1.

Пример 4

Осуществляют, как и Пример 2, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.70 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.25 Хлорид натрия 0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.06 Молибдат натрия 0.0007 Сульфат железа(II) 0.004 Сахароза 22.0 Нановермикулит 1.3 Вода дистиллированная до 1 л

Данные о скорости роста обоих поименованных микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.

Пример 5 (сравнительный)

Осуществляют по той же схеме, что и Пример 2, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов приготавливают питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа (II) 0.003 Сахароза 20.0 Нановермикулит 0.4 Вода дистиллированная до 1 л

Результаты по определению скорости роста вышеуказанных микроорганизмов для этого случая даны в Таблице 1.

Пример 6 (сравнительный)

Проводят, как и Пример 2, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Нановермикулит 1.8 Вода дистиллированная до 1 л

Показатели скорости роста микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.

Пример 7 (сравнительный)

Выполняют, как и Пример 2, но для культивирования консорциума микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.50 Гидрофосфат калия 0.09 Сульфат магния гептагидрат 0.10 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.015 Молибдат натрия 0.0003 Сульфат железа(II) 0.001 Сахароза 14.0 Нановермикулит 1.2 Вода дистиллированная до 1 л

Сведения о скорости роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов для данного случая показаны в Таблице 1.

Пример 8 (сравнительный)

Осуществляют по той же схеме, что и Пример 2, но культивирование консорциума вышеуказанных микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.90 Гидрофосфат калия 0.30 Сульфат магния гептагидрат 0.30 Хлорид натрия 0.35 Сульфат кальция дигидрат 0.09 Молибдат натрия 0.0010 Сульфат железа(II) 0.006 Сахароза 28.0 Нановермикулит 1.2 Вода дистиллированная до 1 л

Показатели скорости роста обоих этих микроорганизмов для отмеченного случая даны в Таблице 1.

Пример 9 (сравнительный)

Проводят так же, как и Пример 2, но для культивирования консорциума микроорганизмов берут питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.50 Гидрофосфат калия 0.09 Сульфат магния гептагидрат 0.10 Хлорид натрия 0.15 Сульфат кальция дигидрат 0.015 Молибдат натрия 0.0003 Сульфат железа(II) 0.001 Сахароза 14.0 Нановермикулит 1.8 Вода дистиллированная до 1 л

Значения скорости роста микроорганизмов для этого случая приведены в Таблице 1.

Пример 10 (сравнительный)

Осуществляют таким же образом, как и Пример 2, но культивирование консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.90 Гидрофосфат калия 0.30 Сульфат магния гептагидрат 0.30 Хлорид натрия 0.35 Сульфат кальция дигидрат 0.09 Молибдат натрия 0.0010 Сульфат железа(II) 0.006 Сахароза 28.0 Нановермикулит 1.8 Вода дистиллированная до 1 л

Данные о скорости роста каждого из вышеуказанных микроорганизмов для рассматриваемого случая представлены в Таблице 1.

Пример 11 (по прототипу [3])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 2, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0006 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Вермикулит 1.3 Вода дистиллированная до 1 л  

Данные о скорости роста микроорганизмов для этого случая приведены в Таблице 1.

Пример 12 (по прототипу [3])

Осуществляют таким же образом, что и Пример 2, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.70 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.25 Хлорид натрия 0.25 Сульфат кальция дигидрат 0.06 Молибдат натрия 0.0007 Сульфат железа(II) 0.004 Сахароза 22.0 Вермикулит 1.6 Вода дистиллированная до 1 л

Результаты по определению скорости роста поименованных выше микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.

Пример 13 (по аналогу [2])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 2, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.64 Гидрофосфат калия 0.16 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Сульфат кальция дигидрат 0.05 Молибдат натрия 0.0005 Сульфат железа(II) 0.003 Сахароза 20.0 Вода дистиллированная до 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая показаны в Таблице 1.

Пример 14 (по аналогу [I])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 1, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия 0.10 Гидрофосфат калия 0.20 Сульфат магния гептагидрат 0.20 Хлорид натрия 0.20 Карбонат кальция 5.00 Сахароза 20.0 Вода дистиллированная до 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для указанного случая также представлены в Таблице 1

Таблица 1 № примера Содержание нановермикулита в питательной смеси, г/л Средняя скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов
(Pseudomonas brassicacearurri), млнт^-1·сут^-1 Средняя скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов {Sphingobacterium multivorum),
млнт^-1·сут^-1 2 0.6 11.0 300.0 3 1.0 10.9 309.1 4 1.3 10.2 304.2 5 (сравнительный) 0.4 8.2 287.2 6 (сравнительный) 1.8 11.0 290.9 7 (сравнительный) 1.2 8.7 281.8 8 (сравнительный) 1.2 8.4 287.2 9 (сравнительный) 1.8 8.2 283.6 10 (сравнительный) 1.8 7.8 276.3 11 (по прототипу [3]) - 5.8 227.2 12 (по прототипу [3]) - 5.8 225.4 13 (по аналогу [2]) - 6.5 31.8 14 (по аналогу [1]) - 11.0 1.1

Как следует из приведенных в Таблице 1 данных, использование заявляемой питательной среды, содержащей нановермикулит в количестве (0.6-1.3) г/л, позволяет весьма значительно увеличить скорости роста как азотфиксирующих {Pseudomonas brassicacearurri), так и фосфатмобилизующих {Sphingobacterium multivorum) микроорганизмов в рамках их консорциума по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [3] и тем более - сред-аналогов [1] и [2]. Отметим, что заявляемые количества нановермикулита в питательной смеси являются существенными: при превышении указанного верхнего заявляемого предела (1.3 г/л) дальнейшего увеличения скорости роста как тех, так и других микроорганизмов уже не наблюдается (и, более того, имеет место даже некоторое ее снижение), при уменьшении же ниже указанного нижнего заявляемого предела (0.6 г/л) имеет место снижение скорости роста.

Аналогичные результаты были получены и на других культурах азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов (в частности, Azotobacter chroococcum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10387 и Achromobacter xylosoxidans, Регистрационный номер в ВКПМ В-10386).

ЛИТЕРАТУРА

[1] Руководство к практическим занятиям по микробиологии. 3-е издание переработанное, под ред. Н.С. Егорова. М.: Издательство Московского университета. 1995. С.204.

[2] Патент РФ 2.177.466 (2001), МПК C05F 11/08, C12N 1/20.

[3] Заявка на изобретение РФ №2012145905 от 26.10.2012, МПК C12N 1/00, C12N 1/20, C12N 1/22 (прототип).

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, нановермикулит и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить скорость роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов. 1 табл., 14 пр.

1. Питательная среда для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа (II), сахарозу, минеральную добавку и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве минеральной добавки она содержит нановермикулит при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
дигидрофосфат калия 0.60-0.70 гидрофосфат калия 0.12-0.20 сульфат магния гептагидрат 0.15-0.25 хлорид натрия 0.15-0.25 сульфат кальция дигидрат 0.02-0.06 молибдат натрия 0.0005-0.0007 сульфат железа(II) 0.002-0.004 сахароза 18.0-22.0 нановермикулит 0.6-1.3 вода дистиллированная до 1 л