КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ВОССТАНОВЛЕНИЯ СУХОЖИЛИЙ Российский патент 2019 года по МПК C12N5/77 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно § 119(e) статьи 35 U.S.C. по предварительной заявке на патент США № 61/763908, поданной 12 февраля 2013 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ НАСТОЯЩЕЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0002] Настоящее изобретение относится к композициям и способам для восстановления сухожилий и, более конкретно, к композициям, содержащим клетки внелуковичной дермальной оболочки для применения в лечении и восстановлении сухожилий, а также для предотвращения повреждений сухожилий.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описание известного уровня техники

[0003] Сухожилия представляют собой жесткие полосы волокнистой соединительной ткани, которые обычно присоединяют мышцу к кости. Примеры обычных сухожилий включают ахиллово сухожилие, которое присоединяет икроножную мышцу к пяточной кости, и сухожилие надколенника, которое соединяет коленную чашечку и берцовую кость.

[0004] Сухожилия могут быть повреждены в ряде случаев, включая, например, чрезмерные нагрузки, напряжение, заболевание и общее старение. Термин "тендинопатия" может применяться в отношении ряда повреждений, включая повреждения, вызванные как воспалением, так и микроразрывами. Сухожилия также могут отрываться или разрываться, что, как правило, требует хирургического вмешательства.

[0005] Существует ряд хирургических способов, которые можно применять для лечения повреждений сухожилий, но, даже с такими способами заживление сухожилий может занять несколько лет, если они вообще заживут. Настоящее изобретение раскрывает новые композиции и способы для лечения повреждений сухожилий и дополнительно предполагает другие связанные преимущества.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] Вкратце, настоящее изобретение предусматривает композиции и способы для лечения или предупреждения повреждений сухожилий с использованием клеток внелуковичной дермальной оболочки волосяного фолликула (“NBDS”). В одном аспекте настоящего изобретения предполагаются способы, предусматривающие стадии (a) получения жизнеспособных (т.е. "живых") волос и (b) культивирования жизнеспособных волос таким образом, чтобы можно было получить популяцию клеток NBDS. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения клетки NBDS являются выделенными.

[0007] В одном аспекте настоящего изобретения предполагаются способы выделения клеток NBDS, предусматривающие стадии (a) получения жизнеспособных волос; (b) разрезания волос, полученных на стадии (a), с удалением луковицы волосяного фолликула (который содержит чашу дермальной оболочки и дермальный сосочек); (c) выделения ткани внелуковичной дермальной оболочки волосяного фолликула и (d) культивирования выделенной ткани внелуковичной дермальной оболочки волосяного фолликула с получением клеток NBDS. В одном варианте осуществления настоящего изобретения жизнеспособные волосы получают с помощью биопсии из затылочной области волосистой части кожи головы субъекта. В другом варианте осуществления волосы разрезают с использованием микроманипулятора и скальпеля. В других вариантах осуществления приведенные в настоящем документе способы дополнительно предусматривают стадию проведения ферментативного расщепления выделенной ткани внелуковичной дермальной оболочки волосяного фолликула, необязательно, с использованием, например, ферментов, расщепляющих коллаген, таких как коллагеназа, диспаза и леупептин. В дополнительных вариантах осуществления клетки пересевают в течение нескольких пассажей.

[0008] В других аспектах настоящего изобретения предполагаются выделенные клетки NBDS, необязательно, полученные в соответствии со способами, описанными выше, где клетки выделяют с целью получения популяции, которая является преимущественно положительной по одному или нескольким из CD90, CD73 и CD49b и/или преимущественно отрицательной по одному или нескольким из CD34, CD45 и KRT14 (необязательно, до или после культивирования). В предпочтительных вариантах осуществления выделенные клетки NBDS являются по меньшей мере на 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 100% положительными по одному или нескольким из положительных маркеров, описанным выше, и/или по меньшей мере на 80%, 90%, 95% или 98% отрицательными по одному из отрицательных маркеров, описанных выше.

[0009] В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения выделенные клетки NBDS характеризуются наличием менее 15%, 10%, 5%, или 1% кератиноцитов в клеточной популяции и/или менее 15%, 10%, 5% или 1% меланоцитов в клеточной популяции. Тем не менее, в дополнительных вариантах осуществления популяцию выделенных клеток NBDS получают из популяции дермальных клеток (предпочтительно из волосяного фолликула), в состав которой входят некоторые нежелательные типы клеток, в том числе, например, по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 0,01%, 0,1% или 1% кератиноцитов в клеточной популяции и/или по меньшей мере 5%, 10%, 0,1%, 0,1% меланоцитов. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения выделенные клетки NBDS являются по меньшей мере на 95% чистыми и содержат по меньшей мере один нежелательный тип клеток (например, по меньшей мере один кератиноцит) в клеточной популяции.

[0010] Эти клетки NBDS (или выделенные клетки NBDS) могут содержаться в композициях с другими ингредиентами, такими как, например, плазма, сыворотка, фибрин и/или гиалуроновая кислота. В других вариантах осуществления клетки NBDS (или выделенные клетки NBDS) могут входить в состав композиции, пригодной для инъекции, например, раствора Рингера с лактатным буфером или буферного солевого раствора. Другие ингредиенты, которые можно использовать для создания композиций по настоящему изобретению, включают, например, компоненты внеклеточного матрикса (например, гликозаминогликаны (GAG), гепарин-сульфат, хондроитин-сульфат, кератин-сульфат, гиалуроновую кислоту, альбумин (например, человеческий альбумин), эластин, фибронектины и ламинины), цитокины и хемокины (например, трансформирующий фактор роста бета (TGF-бета) и его изоформы, инсулиноподобный фактор роста (IGF) и его изоформы, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), белок, родственный паратиреоидному гормону, фактор роста гепатоцитов/"рассеивающий фактор" (HGF/SF), стимулирующий макрофаги белок (MSP), эпидермальный фактор роста (EGF), интерлейкин 6 (IL-6), фактор стромальных клеток 1 (SDF-1), тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и фактор роста фибробластов (FGF) и/или различные терапевтические средства (например, анальгетики, противовоспалительные средства и иммуномодулирующие средства). Однако, в других вариантах осуществления предполагаются клетки NBDS (и выделенные клетки NBDS) в композициях, которые не содержат какого-либо из вышеупомянутых ингредиентов (в том числе, например, сыворотку или плазму).

[0011] В других аспектах настоящего изобретения предполагаются способы лечения или предупреждения повреждений сухожилий, предусматривающие стадию введения субъекту композиции, содержащей клетки NBDS, которые описаны выше (и в предпочтительных вариантах осуществления выделенные клетки NBDS). В одном варианте осуществления субъектом является млекопитающее, выбранное из группы, включающей людей, лошадей, свиней, собак, кошек, морских свинок, кроликов, крыс и мышей.

[0012] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения повреждение сухожилия представляет собой отрыв или разрыв сухожилия или другое повреждение, выбранное из группы, включающей тендиноз, тендосиновит и авульсию. В еще одном варианте осуществления сухожилие представляет собой ахиллово сухожилие или сухожилие надколенника. В других вариантах осуществления сухожилие представляет собой сухожилие сгибателя или сухожилие разгибателя. В других вариантах осуществления повреждения сухожилия следует рассматривать как включающие широкий спектр связанных с сухожилиями заболеваний (в том числе тендинопатий, тендинозов, тендинита, тендосиновита, паратенонита, паратенонита с тендинозом и микроразрывов сухожилия), лечение которых также можно проводить с использованием композиций, приведенных в данном документе. Типичные сухожилия, лечение которых можно проводить, включают, например, а) ахиллово сухожилие (например, тендинопатия средней части ахиллова сухожилия, паратендинопатия ахиллова сухожилия, инсерционная тендинопатия ахиллова сухожилия, ретрокальканеальный бурсит, поверхностный кальканеальный бурсит); b) сухожилия плеча (например, тендинопатия сухожилия двуглавой мышцы плеча, тендинопатия вращательной манжеты плеча); c) сухожилия локтя (например, медиальный или латеральный эпикондилит или «теннисный локоть»); d) ладонь и запястье (например, тендинопатия сгибателей/разгибателей, тендосиновит сгибателей/разгибателей, болезнь Де-Кервена и контрактура Дюпюитрена); е) тендопатии подколенного сухожилия и сухожилия надколенника с микроразрывами или без них и f) подошвенный фасциит с микроразрывами или без них.

[0013] Детали одного или нескольких вариантов осуществления изложены в приведенном ниже описании. Другие признаки, объекты и преимущества будут понятны из описания сущности изобретения, графических материалов и формулы изобретения. Кроме того, раскрытия всех патентов и патентных заявок, упомянутых в данном документе, включены посредством ссылки в своей полноте.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0014] Фигура 1 иллюстрирует срез волосяного фолликула человека. На фигуре 1А показан выделенный волосяной фолликул человека, который может быть разрезан выше луковичной части корня волоса (т.е. выше клеток дермального сосочка и чаши дермальной оболочки), но ниже основания канала сальной железы с целью получения выделенной дермальной оболочки (см. фигуру 1B). Структура, изображенная на фигуре 1В, может быть разделена по меньшей мере на два отдельных компонента, как показано на фигурах 1C и 1D. На фигуре 1С представлены волокно волоса и ассоциированная внутренняя корневая оболочка, а также наружная корневая оболочка, которая содержит преимущественно кератиноциты, и на фигуре 1D представлена дермальная оболочка, содержащая клетки NBDS (также, иногда называемая соединительнотканной оболочкой).

[0015] Фигура 2 является иллюстрацией волосяного фолликула, на которой изображено место происхождения клеток дермального сосочка (“DP”), клеток чаши дермальной оболочки (“DSC”) и клеток внелуковичной дермальной оболочки ("NBDS").

[0016] Фигура 3 представляет собой микрофотографию клеток NBDS в культуре.

[0017] Фигура 4 иллюстрирует клетки NBDS, которые были окрашены в отношении выработки коллагена. Более конкретно, смесь NBDS/плазма в геле подвергали слабому растяжению через 5 дней (фигура 4А) и 12 дней (фигура 4В). Клетки на фигуре 4В заметно темнее, чем на фигуре 4A, что указывает на выработку коллагена типа I.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0018] Как отмечено выше, настоящее изобретение предусматривает клетки внелуковичной дермальной оболочки волосяного фолликула для применения в лечении или предупреждении повреждений сухожилий у млекопитающего. Перед изложением изобретения полезным для его понимания может быть изложение определений некоторых терминов, которые используются в ниже в данном документе.

[0019] Клетки внелуковичной дермальной оболочки или клетки "NBDS" относятся к клеткам, происходящим из дермы (или, более конкретно, полученным из волосяных фолликулов). В предпочтительных вариантах осуществления клетки оболочки получают из наружной дермальной оболочки волосяного фолликула выше луковичной части корня волоса (т.е. выше клеток дермального сосочка и чаши дермальной оболочки), но ниже основания канала сальной железы. Клетки NBDS можно легко идентифицировать с помощью ряда способов, в том числе, например, с помощью способа получения и культивирования (как описано ниже), по морфологии (см., например, фигуру 3), а также по специфическим для клеток маркерам (например, клетки NBDS преимущественно положительны по CD90, CD73 и CD49b, и/или преимущественно отрицательны по CD34, CD45 и KRT14, либо до, либо после культивирования). Тем не менее, во всех случаях клетки должны иметь дермальное происхождение, и более конкретно, фолликулярное происхождение.

[0020] Нарощенные клетки внелуковичной дермальной оболочки, или "клетки eNBDS" относятся к клеткам NBDS, которые подверглись наращиванию в течение нескольких пассажей в культуре, но которые сохраняют способность к выработке коллагена (например, коллагена типа I), а также ряда цитокинов и хемокинов. Указанные выше клетки eNBDS, неожиданно, также могут быть иммунорегуляторными. В предпочтительных вариантах осуществления клетки можно наращивать в культуре в течение 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 пассажей или более.

[0021] "Выделенные" клетки NBDS относятся к клеточной популяции более чем из 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 100% клеток NBDS. Клетки NBDS обладают способностью к выработке коллагена (например, коллагена типа I), а также ряда цитокинов и хемокинов. Неожиданно, клетки NBDS также могут быть иммунорегуляторными, что делает их особенно подходящими для лечения повреждений сухожилий (например, за счет содействия подавлению любого воспалительного ответа).

[0022] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения программное обеспечение или другие методики визуализации, которые можно использовать для визуализации клеток в микроскопическом масштабе, можно применять для оценки размера, формы, жизнеспособности и гранулированности большого количества клеток в поле зрения и определения количества клеток NBDS (которые являются фибробластоподобными, как показано на фигуре 3, в отличие от кератиноцитов, меланоцитов, DSC и других типов клеток, которые имеют отличную морфологию). Следовательно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматриваются способы выделения клеток NBDS, предусматривающие стадию культивирования клеток из волосяного фолликула в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 или 20 пассажей таким образом, чтобы получить популяцию выделенных клеток NBDS. В предпочтительных вариантах осуществления клетки помещают в чашки или колбы, которые обеспечивают возможность прикрепления клеток NBDS, и с каждым пассажем неприкрепившиеся клетки удаляют, а оставшиеся прикрепленные клетки высвобождают (например, с помощью трипсинизации) с последующим добавлением свежей среды. В таких предпочтительных вариантах осуществления можно определить, когда была получена достаточная популяция выделенных клеток NBDS, с помощью визуализации клеток в клеточной культуре с целью оценки количества клеток NBDS в сравнении с клетками, не относящимися к клеткам NBDS. Методики визуализации включают без ограничения непосредственную визуализацию с помощью микроскопии, окрашивание клеток в отношении маркеров (или их отсутствия, например, в отношении отсутствия кератина) и анализ с использованием светового/лазерного излучения для выяснения дифракционного паттерна различных типов клеток (см., в общем смысле, "Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue" Lidia Bakota и Roland Brandt, eds., Humana Press, 2014; см. также "Imaging and Spectroscopic Analysis of Living Cells: Optical and Spectroscopic Techniques”, Conned., Academic Press, 2012).

[0023] В других вариантах осуществления для оценки уровня клеток NBDS в сравнении с нежелательными типами клеток можно применять специфические для клеток маркеры (например, клетки NBDS преимущественно положительны по CD90, CD73 и CD49b и/или преимущественно отрицательны по CD34, CD45 и KRT14 (необязательно, до или после культивирования)). “Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue Regeneration”, Krishan, Krishnamurthy, and Totey eds., Wiley-Blackwell, 2010). Например, выделенные клетки NBDS можно получить путем а) получения одного или нескольких жизнеспособных волосяных фолликулов; b) высвобождения клеток из волосяного фолликула (например, посредством применения ферментов или путем культивирования клеток, растущих из волосяного фолликула) и с) сортировки клеток (например, с помощью проточной цитометрии или посредством применения магнитных гранул) с получением популяции выделенных клеток NBDS. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки на любой стадии способа, необязательно, можно культивировать, как описано выше (например, клетки можно культивировать в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 или 20 пассажей, как описано выше), и полученные в результате клетки можно, кроме того, выделить, например, с помощью проточной цитометрии или магнитных гранул.

[0024] В предпочтительных вариантах осуществления выделенные клетки NBDS являются по меньшей мере на 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 100% положительными по одному или нескольким положительным маркерам, описанным выше, и/или по меньшей мере на 80%, 90%, 95% или 98% отрицательными по одному из отрицательных маркеров, описанных выше.

[0025] В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения (и при использовании любой из методик, описанных в данном документе), выделенные клетки NBDS имеют менее чем 15%, 10%, 5% или 1% кератиноцитов в клеточной популяции и/или менее чем 15%, 10%, 5%, или 1% меланоцитов в клеточной популяции. Однако, в дополнительных вариантах осуществления популяция выделенных клеток NBDS получена из популяции дермальных клеток (предпочтительно, из волосяных фолликулов), которые содержат некоторые нежелательные типы клеток, в том числе, например, по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 0,01%, 0,1% или 1% кератиноцитов в клеточной популяции и/или по меньшей мере 5%, 10%, 0,1%, 0,1% меланоцитов.

[0026] Используемый в данном документе термин "повреждения сухожилия", следует понимать, как относящийся к широкому спектру различных состояний, связанных с сухожилиями, которые приводят или могут, в конечном итоге, привести к трудностям в должном использовании сухожилия (и структур, связанных с сухожилиями, таких как кости и мышцы). Повреждения сухожилия могут включать травматическое повреждение (например, вследствие спортивных травм, чрезмерных нагрузок или медицинского или хирургического вмешательства), повреждение генетического происхождения и заболевание (которое может быть вызвано любым из вышеупомянутого). Типичные повреждения сухожилия включают без ограничения тендинопатии, тендинозы, тендинит, тендосиновит, паратенонит, паратенонит с тендинозом и микроразрывы сухожилия. Типичные сухожилия, лечение которых можно проводить, включают, например, а) ахиллово сухожилие (например, тендинопатия средней части ахиллова сухожилия, паратендинопатия ахиллова сухожилия, инсерционная тендинопатия ахиллова сухожилия, ретрокальканеальный бурсит, поверхностный кальканеальный бурсит); b) сухожилия плеча (например, тендинопатия сухожилия двуглавой мышцы плеча; тендинопатия вращательной манжеты плеча); c) сухожилия локтя (например, медиальный или латеральный эпикондилит или «теннисный локоть»); d) ладонь и запястье (например, тендинопатия сгибателей/разгибателей, тендосиновит сгибателей/разгибателей, болезнь Де-Кервена и контрактура Дюпюитрена); е) тендопатии подколенного сухожилия и сухожилия надколенника с микроразрывами или без них и f) подошвенный фасциит с микроразрывами или без них.

Получение NBDS

[0027] Как отмечено выше, настоящее изобретение предполагает способы выделения клеток NBDS. В одном аспекте настоящего изобретения такие способы предусматривают стадии (a) получения жизнеспособных волос и (b) культивирования жизнеспособных волос таким образом, чтобы можно было получить популяцию клеток NBDS. Что касается стадии (a), широкий спектр способов можно использовать для получения жизнеспособных волос, в том числе, например, хирургические способы для удаления множества волосяных фолликулов (вместе с кожей), или путем выщипывания одного или нескольких волосяных фолликулов непосредственно из субъекта.

[0028] После получения жизнеспособных волос их можно культивировать в условиях, которые обеспечивают возможность роста клеток NBDS и преимущественно стимулируют рост клеток NBDS. В предпочтительных вариантах осуществления это культивирование происходит в условиях, при которых обеспечивается возможность пролиферации фибробластоподобных клеток. В предпочтительных вариантах осуществления стадию культивирования осуществляют с использованием бессывороточной среды. После нескольких пассажей (например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 10 пассажей или более), культивируемые клетки анализируют, как описано выше, чтобы выяснить, присутствует ли достаточное количество клеток NBDS, и были ли клетки в достаточной степени отделены от нежелательных типов клеток.

[0029] В других аспектах настоящего изобретения предполагаются способы, предусматривающие стадии (a) получения жизнеспособных волос; (b) разрезания волос, полученных на стадии (a), с удалением луковицы волосяного фолликула (которая содержит чашу дермальной оболочки и дермальный сосочек); (c) выделения ткани внелуковичной дермальной оболочки волосяного фолликула и (d) культивирования выделенной ткани внелуковичной дермальной оболочки волосяного фолликула с получением клеток NBDS.

[0030] С целью получения жизнеспособных (или «живых») волос образец обычно получают из данного субъекта (например, млекопитающего, такого как человек, лошади, свинья, кошка, собака, кролик, морские свинки, крысы и мыши). Образец можно получить из ряда участков (например, для людей - из затылочной области волосистой части кожи головы, груди или бедра, а для лошадей - из гривы или хвоста). Образец можно получить посредством биопсии или другими подходящими средствами (например, «выщипыванием» или вырезанием). Предпочтительно выбирают волосяные фолликулы, находящиеся на фазе анагена, хотя также можно использовать другие фазы развития (например, фазу катагена).

[0031] После получения образца от субъекта образец разделяют, чтобы выделить волосяной фолликул, как правило, с использованием микроманипулятора и скальпеля, хотя также можно использовать другие инструменты, такие как иглы. В некоторых вариантах осуществления выделенный волосяной фолликул, который показан на фигуре 1А, можно дополнительно разрезать выше луковичной части корня волоса (т.е. выше клеток дермального сосочка и чаши дермальной оболочки), но ниже основания канала сальной железы с целью получения выделенной дермальной оболочки (см. фигуру 1B). Структуру, изображенную на фигуре 1В, можно разделить по меньшей мере на два отдельных компонента, как показано на фигурах 1C и 1D. На фигуре 1С представлены волокно волоса и ассоциированная внутренняя корневая оболочка, а также наружная корневая оболочка, которая содержит преимущественно кератиноциты, и на фигуре 1D представлена дермальная оболочка, содержащая клетки NBDS (также иногда называемая соединительнотканной оболочкой).

[0032] Дермальную оболочку (фигура 1D) в некоторых вариантах осуществления можно дополнительно разделить, например, путем продольного разрезания вдоль одной стороны или с применением таких методик, как ферментативное расщепление (например, ферментами, расцепляющими коллаген, такими как коллагеназа, диспаза и леупептин).

[0033] Дермальную оболочку, содержащая клетки NBDS, или отделенные клетки NBDS можно затем культивировать в среде (либо с сывороткой, либо без нее), которая стимулирует пролиферацию клеток (см., например, фигуру 3). Подходящая среда включает, например, DMEM/Hams F12, дополненную фактором роста фибробластов (FGF), эмбриональной телячьей/бычьей сывороткой и антибиотиками. В качестве альтернативы, клетки можно наращивать бессывороточным способом, в котором используются различные комбинации бессывороточных сред и добавок. Примеры бессывороточных сред включают X-Vivo™ и TheraPEAK™ FGM-CD™, содержащие сывороточные добавки и/или экстракт тромбоцитов человека. Как правило, после 3-5 дней свежую среду для пролиферации добавляют в культуральную среду. Затем среду можно менять каждые 2-4 дня. Когда культура достигла конфлюэнтности примерно 80-90%, клетки снимают культурального флакона посредством трипсинизации и высевают в колбу для культуры ткани большего объема. Эту стадию повторяют в течение нескольких пассажей (например, 2, 4 или 6) до тех пор, пока не будет получено от 5 до 100 миллионов клеток.

[0034] После получения необходимого количества клеток клетки промывают несколько раз, трипсинизируют и ресуспендируют в среде для транспортировки клеток (CTM), которая состоит из раствора Рингера, забуференного лактатом, 10% сывороточного альбумина человека (HAS) и 5% диметилсульфоксида (DMSO). Клетки подсчитывают, объем доводят для получения конечной концентрации 20 миллионов клеток/мл и хранят в жидком азоте.

Получение композиций, содержащих клетки NBDS

[0035] Как отмечено выше, клетки NBDS (и выделенные клетки NBDS) могут содержаться в композициях с другими ингредиентами, такими как, например, сыворотка, плазма, обогащенная тромбоцитами плазма, альбумин (например, человеческий альбумин), фибрин и/или гиалуроновая кислота. Другие коммерчески доступные продукты также можно использовать для получения подходящих композиций, в том числе, например, TISSEEL и COSEAL (доступный у Baxter), TISSUCOL, BERIPLAST, QUIXIL, TACHOSIL и EVICEL. Также можно использовать другие композиции на основе полимеров, в том числе, например, полиэтиленгликоли, полимолочные кислоты и поликапролактоны. В предпочтительных вариантах осуществления композицию обеспечивают в виде одной или двух частей (например, в двуствольном шприце, который смешивает компоненты), которые являются свободнотекучими и пригодными для инъекций.

[0036] В данные композиции также можно включать другие ингредиенты, в том числе, например, компоненты внеклеточного матрикса (например, гликозаминогликаны (GAG), гепарин-сульфат, хондроитин-сульфат, кератин-сульфат, гиалуроновую кислоту, эластин, фибронектины и ламинины), цитокины и хемокины (например, трансформирующий фактор роста бета (TGF-бета) и его изоформы, инсулиноподобный фактор роста (IGF) и его изоформы, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), белок, родственный паратиреоидному гормону, фактор роста гепатоцитов/"рассеивающий фактор" (HGF/SF), стимулирующий макрофаги белок (MSP), эпидермальный фактор роста (EGF), интерлейкин 6 (IL-6), фактор стромальных клеток 1 (SDF-1), тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и фактор роста фибробластов (FGF) и/или различные терапевтические средства (например, анальгетики, противовоспалительные средства и иммуномодулирующие средства).

Способы лечения повреждений сухожилий с использованием клеток NBDS

[0037] Также предполагаются способы лечения или предупреждения повреждений сухожилий, предусматривающие стадию введения субъекту композиции, содержащей клетки NBDS (в том числе композиций с выделенными клетками NBDS, как описано выше). Как правило, клетки вводят путем инъекции, хотя в различных вариантах осуществления при использовании хирургического способа клетки можно доставлять непосредственно в открытую рану. Иллюстративные примеры подходящих способов введения включают стандартный шприц, а также специализированные устройства, такие как раскрытые в заявке на патент США № 12/153248 и PCT публикации заявки WO/2013/113121, причем обе них включены в данный документ в своей полноте посредством ссылки.

[0038] С использованием клеток NBDS (и выделенных клеток NBDS) и способов, приведенных в данном документе, можно осуществлять лечение или предупреждение широкого спектра повреждений сухожилий. Например, также могут осуществлять лечение отрывов или разрывов сухожилий, полученных в результате несчастных случаев или повреждений, поражения или заживления в результате хирургических операций. Кроме того, также можно осуществлять лечение других хронических повреждений, в том числе, например, тендинопатий, таких как тендинит или тендиноз, тендосиновит и авульсия.

[0039] С помощью клеток NBDS (и выделенных клеток NBDS) и композиций, приведенных в данном документе, можно осуществлять лечение широкого спектра сухожилий. Например, в одном варианте осуществления подвергаются лечению сухожилия, которые были повреждены из-за заболевания и/или травмы (например, из-за медицинской или хирургической травмы или другого повреждения). Сухожилия могут отрываться и/или могут иметь полные или частичные разрывы (или микроразрывы). Примеры связанных с сухожилиями повреждений включают тендинопатии, тендинозы, тендинит, тендосиновит, паратенонит, паратенонит с тендинитом и микроразрывы сухожилия. Иллюстративные сухожилия, лечение которых можно проводить, включают, например, а) ахиллово сухожилие (например, тендинопатия средней части ахиллова сухожилия, паратендинопатия ахиллова сухожилия, инсерционная тендинопатия ахиллова сухожилия, ретрокальканеальный бурсит; поверхностный кальканеальный бурсит); b) сухожилия плеча (например, тендинопатия сухожилия двуглавой мышцы плеча, тендопатия вращательной манжеты плеча); c) сухожилия локтя (например, медиальный или латеральный эпикондилит или «теннисный локоть»); d) ладонь и запястье (например, тендинопатия сгибателей/разгибателей, тендосиновит сгибателей/разгибателей, болезнь Де-Кервена и контрактура Дюпюитрена); е) тендопатии подколенного сухожилия и сухожилия надколенника с микроразрывами или без них и f) подошвенный фасциит с микроразрывами или без них.

[0040] Большое количество видов организмов может подвергаться лечению клетками NBDS (и выделенными клетками NBDS) и композициями, приведенными в данном документе, в том числе, например, млекопитающие, такие как люди, лошадей, свиньи, собаки, кошки, кролики, морские свинки, крысы и мыши.

[0041] Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение, и их не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Пример 1

Взятие образцов ткани

[0042] Биопсию кожи с затылочной области волосистой части кожи головы получали у субъекта следующим образом. Вкратце, после выбора соответствующей области волосистой части кожи головы ее брили с помощью машинки для стрижки волос, обеспечивая наличие остаточной щетины. Затем область взятия биопсии тщательно дезинфицировали и анестезировали. После того как анестезия подействовала, пункционную биопсию глубиной 4-10 мм осторожно удаляли из места взятия биопсии, а на место разреза накладывали швы, которые могли быть удалены через 12-14 дней. Затем в асептических условиях биопсию кожи помещали в предварительно промаркированную пробирку для биопсии, содержащую среду для транспортировки биопсии, состоящую из DMEM/Hams F12 с антибиотиками.

Пример 2

Выделение и культивирование клеток NBDS

[0043] Проверку стерильности осуществляли на среде, в которой транспортировалась биопсия, чтобы удостовериться в отсутствии контаминации образца или, в качестве альтернативы, если образец контаминирован, чтобы удостовериться в дальнейшей утилизации среды с антибиотиками. Затем биопсию промывали несколько раз для удаления среды для транспортировки биопсии и какого-либо дебриса с получением ткани для последующей обработки. Волосяные фолликулы обрабатывали в Hams F10 путем срезания эпителия кожи с помощью стерильного скальпеля и "выщипывания" или вырезания участка с целым волосяным фолликулом из окружающей дермальной ткани с использованием стерильного пинцета. Волосяной фолликул захватывали пинцетом как можно ближе к поверхности кожи и фолликул обнажали путем вытягивания за волос в участке с волосяным фолликулом. Фолликулы в фазе анагена (фаза роста в цикле развития волос, на которую указывает видимая наружная корневая оболочка и DSC волосяной луковицы) выбирали для дальнейшей обработки.

[0044] Выделение NBDS выполняли в Hams F10 путем первоначального отделения клеток чаши дермальной оболочки фолликула и сосочка от остальной части волосяного фолликула с помощью стерильного мини-скальпеля или иглы и их удаления. Дермальную оболочку, содержащую клетки NBDS, удаляли и получали ткань для культивирования.

[0045] От шести до десяти образцов ткани дермальной оболочки осторожно помещали в гель с 3% гиалуроновой кислотой и покрывали культуральной средой, стимулирующей пролиферацию клеток, такой как, например, DMEM/Hams F12, дополненной FGF, 10% FCS и антибиотиками. Через 3-5 дней в культуру добавляли свежую среду для пролиферации. В дальнейшем среду меняли каждые 2-4 дня. Когда культура достигла конфлюэнтности примерно 80-90%, клетки снимали с культурального флакона с помощью трипсинизации и высевали в колбы для культуры ткани большего объема. Эту стадию повторяли в течение четырех пассажей с получением примерно 100 миллионов клеток.

[0046] После получения примерно 100 миллионов клеток их промывали PBS, трипсинизировали и ресуспендировали в среде для транспортировки клеток (CTM: раствор Рингера, забуференный лактатом, 10% сывороточный альбумин человека и 5% диметилсульфоксид). Клетки осаждали центрифугированием и объединяли. Супернатант отсасывали и осадок клеток ресуспендировали в CTM. Два образца клеток/аликвоты удаляли из смеси клетки-CTM для контроля качества и подсчета клеток. После подсчета клеток их снова осаждали центрифугированием и полученный в результате осадок ресуспендировали в CTM с получением конечной концентрации 20 миллионов клеток/мл. Конечные клеточные продукты хранили при температуре ниже -130°С в жидком азоте до перевозки.

Пример 3

Получение и введение клеток NBDS в сухожилие

[0047] Получали клетки для применения в двухкамерном шприце. Первая камера содержала примерно 20 миллионов клеток, суспендированных в общем объеме 1 мл. Вторая камера содержала 1,5 мл аутологичной плазмы от пациента (полученной отдельно перед этой процедурой).

[0048] Двухкамерный шприц применяли для введения клеток (под контролем ультразвука) в несколько мест в сухожилии, которое нужно восстановить.

Пример 4

Синтез коллагена типа I в исследованиях с растяжением сухожилий

[0049] Вкратце, 1,5 мл замороженных клеток NBDS (всего 3 миллиона клеток) оттаивали путем смешивания с 0,15 мл CaCl₂ (500 мМ маточный раствор). Добавляли 1,5 мл плазмы и суспензию переносили в овальную отливочную форму. По прошествии примерно одного часа образовывался гель, который может быть удален из формы. Затем кольцо помещали в машину, которая может растягивать сформованную кольцевую структуру в течение времени. Можно производить измерения в отношении силы натяжения, приложенной в течение времени.

[0050] Сформованное кольцо также можно удалить, зафиксировать в параформальдегиде и провести иммуногистохимическое окрашивание на наличие одного или нескольких белков (например, коллагена типа I, коллагена типа III, бигликана, тенасцина C, эластина, теномодулина и декорина).

[0051] Как показано на фигуре 4, смесь клетки NBDS/плазма в геле подвергали легкому растяжению после 5 дней (фигура 4А) и 12 дней (фигура 4В). Проводили иммунохимическое окрашивание образцов на выработку коллагена типа I (с пероксидазой хрена). Окрашивание на фигуре 4B заметно темнее (коричневый), чем на фигуре 4А, это указывает на то, что клетки были положительными в отношении выработки коллагена, которая повышалась после механического растяжения. Результаты этих исследований четко демонстрируют, что клетки NBDS способны к выработке коллагена и образованию подобных сухожилиям структур in vitro. В частности, клетки сформованном геле ориентированы в соответствии с направлением растяжения (подобно клеткам в нормальном сухожилии).

[0052] Различные варианты осуществления, описанные выше, могут быть объединены с получением дополнительных вариантов осуществления. Все из патентов США, публикаций заявок на патент США, заявок на патент США, иностранных патентов, иностранных патентных заявок и непатентных публикаций, указанных в данном описании изобретения и/или перечисленных в сведениях о заявке, включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Аспекты вариантов осуществления можно модифицировать, если необходимо, с использованием идей из различных патентов, заявок и публикаций для обеспечения дополнительных вариантов осуществления.

[0053] Эти и другие изменения могут быть сделаны в вариантах осуществления в свете вышеприведенного подробного описания. В целом, в нижеследующей формуле изобретения используемые термины не следует толковать как ограничивающие формулу изобретения конкретными вариантами осуществления, раскрытыми в описании изобретения и формуле изобретения, а их следует толковать как включающие все возможные варианты осуществления вместе с полным объемом эквивалентов, к которым относится такая формула изобретения. Соответственно, формула изобретения не ограничивается раскрытием изобретения.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу выделения клеток внелуковичной дермальной оболочки волосяного фолликула (NBDS), и может быть использовано в медицине. Ткань внелуковичной дермальной оболочки, полученную из жизнеспособных волос затылочной части головы, подвергают ферментативному расщеплению с последующим культивированием выделенной ткани внелуковичной дермальной оболочки в среде, которая стимулирует пролиферацию клеток, с получением клеток NBDS. Изобретение позволяет получать клетки NBDS, синтезирующие коллаген и пригодные для применения в лечении повреждений сухожилий. 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

1. Способ выделения клеток внелуковичной дермальной оболочки волосяного фолликула (NBDS), предусматривающий:

(a) получение жизнеспособных волос при помощи биопсии из затылочной области волосистой части кожи головы субъекта;

(b) разрезание волос, полученных на стадии (а), с удалением луковицы волосяного фолликула и выделением волосяного фолликула;

(c) выделение ткани внелуковичной дермальной оболочки путем последующего разрезания выделенного волосяного фолликула выше луковичной части корня волоса, но ниже основания канала сальной железы;

(d) проведение ферментативного расщепления указанной выделенной ткани внелуковичной дермальной оболочки; и

(e) культивирование выделенной ткани внелуковичной дермальной оболочки в среде, которая стимулирует пролиферацию клеток, с получением клеток NBDS.

2. Способ по п. 1, где указанные волосы разрезают с использованием микроманипулятора и скальпеля.

3. Способ по п. 1, где указанное ферментативное расщепление проводят с использованием коллагеназы.

4. Способ по п. 1, где указанные клетки NBDS культивируют в течение нескольких пассажей либо в среде, содержащей сыворотку, либо в бессывороточной среде.