ВАРИАНТЫ ПЕРТУЗУМАБА И ИХ АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Российский патент 2020 года по МПК A61K39/395 A61P35/00 

По данной заявке, поданной в соответствии с 37 CFR §1.53(b), испрашивается приоритет в соответствии с 35 USC §119(e) предварительной заявки США с серийным номером 61/812603, поданной 16 апреля 2013 года, которая включена посредством ссылки в полном объеме.

Перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, представленный через EFS-Web, и, таким образом, включенный посредством ссылки в полном объеме. Указанная ASCII копия, созданная 8 апреля 2014, названа P5584Rl-WO_SeqList.txt, и размер которой составляет 31363 байт.

Область техники

Настоящее изобретение относится к вариантам пертузумаба. В частности, настоящее изобретение относится к вариантам с неспаренными цистеинами, содержащим Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба, к лишенному фукозы варианту пертузумаба, разновидностям пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS), и разновидностям пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS). Настоящее изобретение дополнительно относится к выделенным вариантам, композициям, фармацевтическим композициям и изделиям, содержащим указанные варианты, а также к способам получения и характеристики таких вариантов и их композиций.

Уровень техники

Пертузумаб (PERJETA®) (также называемый rhuMAb 2С4) представляет собой моноклональное антитело (MAb), которое является первым в своем классе в линии средств, называемых «ингибиторами димеризации HER». Связываясь с HER2, пертузумаб ингибирует димеризацию HER2 с другими рецепторами HER и, таким образом, ингибирует опухолевый рост. Пертузумаб получил разрешение Управления по контролю качества продуктов питания и лекарственных средств США (US FDA) на использование для лечения HER2-позитивного метастатического рака молочной железы 8 июня 2012 года.

В патенте США 7862817 (Adams et al.) описывается гуманизированный вариант антитела 2С4, названный гуманизированной 2С4 версией 574 или рекомбинантным гуманизированным моноклональным антителом 2С4 (rhuMAb 2С4). Это антитело связывало субдомен II во внеклеточном домене (ECD) рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2). Антитело rhuMAb 2С4 было получено в лабораторном масштабе и было показано, что оно связывается с HER2 и ингибирует рост клеток MDA-175 (которые экспрессируют HER2 на уровне 1+) и ксенотрансплантатов MCF7, имплантированных мышам. Смотри, также, Adams et al. Cancer Immunol. Immunother. 55(6):717-727 (2006).

В патенте США 6339142 (Blank and Basey) описывается композиция антитела к HER2, содержащая смесь анти-HER2 антитела и один или более его кислых вариантов, где количество кислого варианта (вариантов) составляет примерно менее 25%. Гуманизированное моноклональное антитело 4D5 вариант 8 (humMAb4D5-8 или трастузумаб) является примером антитела к HER2.

В патенте США 7560111, в патенте США 7879325 и в патенте США 8241630 (Као et al.) описывается вариант пертузумаба (rhuMAb 2С4), содержащий аминоконцевое лидерное удлинение (VHS-) на одной или обеих легких цепях антитела, так называемый «VHS-вариант». В тех случаях, когда эталонное вещество (Фаза I), Lot S9802A (Фаза II) и вещество технологической разработки в масштабе 400 л тестировали на свободные тиолы, используя анализ Эллмана в нативных условиях, уровень свободных тиолов был ниже предела обнаружения во всех тестируемых веществах. От 1-2% пертузумаба в тестируемых композициях были лишены фукозы (G0-F) по данным капиллярного электрофореза (СЕ) Смотри таблицу 5 патента США 7560111 (Као et al.).

В WO 2009/099829 (Harris et al.) описываются варианты пертузумаба, включающие дезамидированный вариант, гликозилированный вариант, вариант с восстановленными дисульфидами, невосстанавливаемый вариант и сиалилированный вариант. Эти варианты были охарактеризованы, как описано следующим образом:

Экспериментальный способ, используемый для характеристики варианта с восстановленным дисульфидом в WO 2009/099829 (Harris et al.), невосстановленного CE-SDS интактного антитела, определял восстановленные межцепочечные дисульфидные связи, а не внутрицепочечные дисульфидные связи.

Zhang et al. Anal. Chem. 84(16):7112-7123 (2012) описывают рекомбинантное антитело (mAb А), имеющее неспаренные цистеины (Cys22 и Cys96) в его вариабельном домене тяжелой цепи (VH домене). Было обнаружено, что неспаренные цистеины не оказывают существенного воздействия на связывание антитела с CD20, a mAb А с неспаренными цистеинами было полностью активным в анализе специфической активности (комплемент-зависимая цитотоксичность, CDC, анализ).

WO 2009/009523 (Као et al.) раскрывает предотвращение восстановления межцепочечных дисульфидных связей во время рекомбинантной продукции окрелизумаба (rhuMAb 2Н7), антитела, которое связывается с CD20.

Harris, R. Dev. Biol. (Basel, Switzerland) 122: 117-127 (2005) описали неспаренные цистеины (Cys22 и Cys96) в вариабельном домене тяжелой цепи (VH) омализумаба, гуманизированного антитела к IgE. Формы с неспаренными цистеинами имели значительно меньшую специфическую активность.

Сущность изобретения

Экспериментальные данные в настоящем описании относятся к формам вариантов пертузумаба, включающих вариант с неспаренными цистеинами, вариант, лишенный фукозы, разновидности с низкой молекулярной массой (LMWS) и разновидности с высокой молекулярной массой (HMWS). Средства для идентификации, характеристики и количественной оценки этих вариантов являются чрезвычайно полезными при производстве и в способах контроля качества для лекарственной композиции пертузумаба.

Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей пертузумаб и его вариант с неспаренными цистеинами, где вариант с неспаренными цистеинами содержит Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба. Вариант с неспаренными цистеинами включает гетеродимерный вариант (содержащий Cys23/Cys88 неспаренные цистеины только в одном вариабельном домене легкой цепи пертузумаба) и/или гомодимерный вариант (содержащий Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба).

Композиция необязательно дополнительно содержит один или более дополнительных вариантов пертузумаба, например, вариант, лишенный фукозы, вариант разновидности с низкой молекулярной массой (LMWS), вариант разновидности с высокой молекулярной массой (HMWS), гликозилированный вариант, вариант с восстановленным дисульфидом, невосстанавливаемый вариант, дезамидированный вариант, сиалилированный вариант, VHS-вариант, вариант с С-концевым лизином, вариант с окисленным метионином, вариант гликозилирования G1, вариант гликозилирования G2 и вариант с негликозилированной тяжелой цепью.

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей пертузумаб и вариант пертузумаба, лишенный фукозы, где количество варианта, лишенного фукозы составляет от 0,9 до 4,1% композиции. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей пертузумаб и вариант пертузумаба, лишенный фукозы, где количество варианта, лишенного фукозы, составляет более 2% композиции. В соответствии с этим вариантом осуществления количество варианта, лишенного фукозы, превышает количество, описанное в патенте США 7560111, в патенте США 7879325 и в патенте США 8241630 (Као et al.).

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей смесь пертузумаба, разновидностей пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS), и пертузумаба разновидностей с высокой молекулярной массой (HMWS), где количество LMWS составляет ≤1,6%, а количество HMWS составляет ≤1,7%.

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей смесь пертузумаба, Пик 1 и Пик 2, где количество Пика 1 составляет ≤0,5%, а количество Пика 2 составляет ≤1,0% по данным анализа капиллярного электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия в редуцирующих условиях (R-CE-SDS).

Дополнительные аспекты настоящего изобретения относятся к фармацевтическим композициям, изделиям и способам лечения пациента, страдающего злокачественным заболеванием, использующих или содержащих композиции по настоящему изобретению.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки композиции пертузумаба, включающему: (1) количественное определение содержания варианта с неспаренными цистеинами в композиции, где вариант с неспаренными цистеинами содержит Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах тяжелой цепи пертузумаба; и/или (2) количественное определение содержания лишенного фукозы пертузумаба в композиции; и/или (3) количественное определение содержания разновидностей пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS) или разновидностей с высокой молекулярной массой (HMWS) в композиции.

Еще в одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки биологической активности композиции пертузумаба, включающему определение количества варианта пертузумаба, лишенного фукозы, в композиции для определения активности антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) композиции, и подтверждение того, что количество пертузумаба, лишенного фукозы, находится в диапазоне примерно от 0,9 примерно до 4,1%.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции, включающему: (1) получение композиции, содержащей пертузумаб и один или более его вариантов, и (2) и проведение аналитического исследования полученной таким образом композиции для оценки в ней количества вариантов, где варинат(ы) включают: (i) вариант с неспаренными цистеинами, содержащий Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба; и/или (ii) вариант пертузумаба, лишенный фукозы; и/или (iii) разновидности пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS); и/или (iv) разновидности пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS), и/или (v) Пик 1 фрагмент(ы) пертузумаба, и/или (vi) Пик 2 фрагмент(ы) пертузумаба.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному варианту пертузумаба, где выделенный вариант содержит: (а) вариант пертузумаба с неспаренными цистеинами, где вариант представляет собой гетеродимерный вариант, содержащий Cys23/Cys88 неспаренные цистеины только в одном вариабельном домене легкой цепи пертузумаба; и/или (b) вариант пертузумаба с неспаренными цистеинами, где вариант представляет собой гомодимерный вариант, содержащий Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба; и/или (с) вариант пертузумаба, лишенный фукозы; и/или (d) разновидности пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS); и/или (е) разновидности пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS); и/или (f) Пик 1 фрагмент(ы) пертузумаба, и/или (g) Пик 2 фрагмент(ы) пертузумаба.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки, фрагментации композиции пертузумаба, включающему определение количества Пика 1 и Пика 2 в композиции с помощью капиллярного электрофореза с додецилсульфатом натрия в редуцирующих условиях (R-CE-SDS) и подтверждение того, что количество Пика 1 составляет ≤5%, а количество Пика 2 составляет ≤1,0%.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена схематичная структура белка HER2 и аминокислотные последовательности для субдоменов I-IV (SEQ ID Nos. 1-4, соответственно) его внеклеточного домена.

На фиг. 2А и 2В представлены выравнивания аминокислотных последовательностей вариабельных доменов легкой цепи (VL) (Фиг. 2А) и вариабельных доменов тяжелой цепи (VH) (Фиг. 2В) мышиного моноклонального антитела 2С4 (SEQ ID Nos. 5 и 6, соответственно); Домены VL и VH варианта 574/пертузумаб (SEQ ID Nos. 7 и 8, соответственно), и консенсусные каркасные области VL и VH (hum κ1, легкая каппа цепь подгруппа I; humIII, тяжелая подгруппа III) (SEQ ID Nos. 9 и 10, соответственно). Звездочки показывают различия между вариабельными доменами пертузумаба и мышиного моноклонального антитела 2С4 или между вариабельными доменами пертузумаба и каркасной областью антитела человека. Области, определяющие комплементарность (CDR), показаны в скобках.

На фиг. 3А и 3В показаны аминокислотные последовательности легкой цепи (Фиг. 3А; SEQ ID NO. 11) и тяжелой цепи (Фиг. 3В; SEQ ID No. 12) пертузумаба. CDR показаны жирным шрифтом. Вычисленная молекулярная масса легкой цепи и тяжелой цепи составляет 23526,22 Да и 49216,56 Да (цистеины в восстановленной форме). Углеводная часть молекулы присоединена к Asn 299 тяжелой цепи.

На фиг. 4А и 4В показаны аминокислотные последовательности легкой цепи (Фиг. 4А; SEQ ID NO. 13) и тяжелой цепи (Фиг. 4В; SEQ ID NO. 14) трастузумаба, соответственно. Границы вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи показаны стрелками.

На фиг. 5А и 5В показана последовательность легкой цепи варианта пертузумаба (Фиг. 5А; SEQ ID NO. 15) и последовательность тяжелой цепи варианта пертузумаба (Фиг. 5В; SEQ ID NO. 16), соответственно.

На фиг. 6 изображена структура (основных видов) пертузумаба, включающая его 4 межцепочечные и 12 внутрицепочечные дисульфидные связи, в том числе, Cys23/Cys88 внутрицепочечные дисульфидные связи в каждом из вариабельных доменов легкой цепи (VL). Изображенные домены представляют собой: VL = вариабельный домен легкой цепи; VH = вариабельный домен тяжелой цепи; CL = константный домен легкой цепи; СН1 = константный домен 1 тяжелой цепи 1; СН2 = константный домен 2 тяжелой цепи; СН3 = константный домен 3 тяжелой цепи.

На фиг. 7 показаны невосстановленные (нативные) трипсиновые пептидные карты пертузумаба.

На фиг. 8 изображены трипсиновые пептидные карты восстановленного и невосстановленного пертузумаба (полноразмерные).

На фиг. 9 изображены трипсиновые пептидные карты восстановленного и невосстановленного пертузумаба (0-120 минут).

На фиг. 10 изображены трипсиновые пептидные карты восстановленного и невосстановленного пертузумаба (120-204 минут).

На фиг. 11 изображен хроматографический анализ с гидрофобным взаимодействием (HIC) пертузумаба, расщепленного папаином.

На фиг. 12 изображен HIC анализ пертузумаба, расщепленного папаином (развернутый вид).

На фиг. 13 изображен HIC анализ интактного пертузумаба. Показаны пики, содержащие: гомодимер, обогащенный свободным тиолом (свободные тиолы на обеих легких цепях), гетеродимер со свободными тиолами (свободный тиол на одной легкой цепи), и гомодимер дикого типа (основные виды антитела).

На фиг. 14 изображена активность пертузумаба (партия анти2С4907-2) в анализе антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).

На фиг. 15 изображено влияние уровня G0-F на ADCC активность. Тестируемые образцы представляли собой пертузумаб фазы III (G0-F=2,2%) и пертузумаб фазы I (G0-F=0,8%).

На фиг. 16 изображен капиллярный электрофоретический анализ N-связанных олигосахаридов, выделенных из пертузумаба.

На фиг. 17 изображен капиллярный электрофоретический анализ N-связанных олигосахаридов, выделенных из пертузумаба (развернутый вид). Примечание: олигосахарид G1 имеет две изомерные формы (меченый G1 и G1'), где концевой остаток галактозы присоединен либо к ветви α1-6, либо к ветви α1-3.

На фиг. 18 изображена высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой (HP-HPLC) для разделения Fab и Fc пертузумаба (ограниченное Lys-C расщепление). Показан пертузумаб с ограниченным Lys-C расщеплением и пертузумаб с ограниченным Lys-C расщеплением, затем обработанные N-этилмалеимидом (NEM).

На фиг. 19 изображено пептидное картирование, подтверждающее, что Fab пертузумаба со свободным тиолом содержит свободные Cys23 и Cys88 в своей легкой цепи. L2 пептид из Fab, содержащего свободные тиолы, был помечен с использованием NEM, и, таким образом, сдвинут в анализе пептидного картирования.

На фиг. 20 схематически изображены: основные виды IgG1 дикого типа (Фиг. 20А), гетеродимерный вариант Cys23/Cys88 (Фиг. 20В) и гомодимерный вариант Cys23/Cys88 (Фиг. 20С).

На фиг. 21 изображен % G0-F как функция активности ADCC для партий пертузумаба с использованием исследования из примера 4 настоящего описания.

На фиг. 22 схематически изображено связывание пертузумаба в гетеродимерном сайте связывания HER2, таким образом, препятствующее гетеродимеризации с активированным EGFR или HER3.

На фиг. 23 представлено сравнение активностей трастузумаба (который связывается с субдоменом IV рядом с околомембранным доменом HER2 ECD) и пертузумаба (который связывается с субдоменом II HER2 ECD).

На фиг. 24А и 24В изображены структуры олигосахаридов, присоединенных к антителу IgG.

На фиг. 25 изображен гель-хроматографический (SEC) анализ пертузумаба (в натуральную величину).

На фиг. 26 изображен SEC анализ пертузумаба (увеличенный масштаб). Пики включают основной пик (основные виды антитела), разновидности с высокой молекулярной массой (HMWS) и разновидности с низкой молекулярной массой (LMWS).

На фиг. 27 изображен эксклюзионной высокоэффективный жидкостной хроматографический анализ (SE-HPLC) образцов пертузумаба. Образец А представляет собой репрезентативную партию лекарственного средства пертузумаб. Образец В представляет собой партию пертузумаба, подверженную воздействию света при 1,2 млюкс-час. Образец С представляет собой партию пертузумаба, подверженную воздействию света при 3,6 млюкс часов. Образец D представляет собой партию пертузумаба, подверженную обработке кислотой при рН 3,2. Образец Ε представляет собой очищенные основные варианты в результате ионобменной HPLC (IE-HPLC).

На фиг. 28 изображен график соответствия аналитического ультрацентрифугирования (AUC) для определения скорости седиментации и SE-HPLC анализа. Планки погрешностей представляют два стандартных отклонения от n=3 определения. Все другие точки данные обозначают однократное определение. Кружочки обозначают образцы, которые имеют уровни HMWS ниже уровня обнаружения с помощью AUC.

На фиг. 29 изображен капиллярный электрофоретический анализ с додецилсульфатом натрия (CE-SDS) с индуцированной лазером флуоресцентным обнаружением (LIF) невосстановленного пертузумаба.

На фиг. 30 изображен CE-SDS-LIF невосстановленного (NR) пертузумаба (развернутый вид).

На фиг. 31А и 31В изображены SE-HPLC хроматограммы для примера 6: в натуральную величину (Фиг 31А) и увеличенный масштаб (Фиг. 31В).

На фиг. 32А и 32В изображены электрофореграммы CE-SDS (NR-CE-SDS) в нередуцирующих условиях для примера 6: в натуральную величину (Фиг. 32А) и увеличенный масштаб (Фиг. 32В).

На фиг. 33А и 33В изображены электрофореграммы CE-SDS (R-CE-SDS) в редуцирующих условиях для примера 6: в натуральную величину (Фиг. 33А), и увеличенный масштаб (Фиг. 33В).

На фиг. 34 представлено сравнение электрофореграмм NR-CE-SDS и R-CE-SDS для образца, обработанного кислотой (увеличенный масштаб).

На фиг. 35 изображена корреляция количественной оценки Fab между NR-CE-SDS и SE-HPLC.

Подробное описание изобретения

I. Определения

«Спаренные цистеины» в настоящем описании относятся к двум остаткам цистеина, которые образуют дисульфидную связь в белке, таком как антитело. Такая дисульфидная связь может представлять собой межцепочечную дисульфидную связь (например, дисульфидную связь между тяжелой и легкой цепями антитела, или между двумя тяжелыми цепями антитела), или внутрицепочечную дисульфидную связь (например, в пределах легкой цепи антитела или в пределах тяжелой цепи антитела). Большинство IgG1 антител содержит четыре межцепочечные дисульфидные связи и двенадцать внутрицепочечных дисульфидных связей. Смотри Фиг. 6.

«Вариант с неспаренными цистеинами» представляет собой вариант белка (например, антитела, такого как пертузумаб), в котором один или более спаренных цистеинов не находятся в дисульфид-связанном состоянии. Такие неспаренные цистеины могли быть неспаренными для образования дисульфидной связи (например, когда белок первоначально укладывается в третичную структуру) или могли сформировать дисульфидную связь, но которая позже была разорвана (например, во время производства или при хранении). Неспаренные цистеины зачастую называют свободными тиолами или свободными сульфгидрилами. В одном варианте осуществления неспаренные цистеины образуют внутрицепочечную дисульфидную связь. В одном варианте осуществления неспаренные цистеины находятся в легкой цепи, например, вариабельном домене легкой цепи анитела. В одном варианте осуществления вариант с неспаренными цистеинами представляет собой Cys23/Cys88 вариант.

«Cys23/Cys88» вариант с неспаренными цистеинами лишен внутримолекулярной дисульфидной связи у остатков цистеина 23 и 88 в одном или обоих вариабельных доменах легкой цепи антитела. Смотри Фиг. 20(b) и (с) в настоящем описании.

«Гомодимерный вариант» лишен дисульфидных связей Cys23/Cys88 в обоих вариабельных доменах легкой цепи антитела. Смотри Фиг. 20(c) в настоящем описании.

«Гетеродимерный вариант» лишен только одной дисульфидной связи Cys23/Cys88 в вариабельном домене легкой цепи антитела. Смотри Фиг. 20(b) в настоящем описании.

«Вариант, лишенный фукозы» представляет собой гликозилированный вариант антитела, в котором одна или обе олигосахаридные структуры присоединенные к остатку Asn299 одной или обеих тяжелых цепей, лишены фукозы, например, лишены Fucα(1->6), в ядре олигосахаридной структуры.

«Разновидности с низкой молекулярной массой» или «LMWS» пертузумаба включают фрагмент пертузумаба, молекулярная масса которого ниже молекулярной массы основных видов или интактного пертузумаба (например, где интактный пертузумаб имеет молекулярную массу примерно 145197 Да, измеряя только его пептидные цепи). LMWS могут быть обнаружены с помощью эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC) и/или капиллярного электрофореза с додецилсульфатом натрия в нередуцирующих условиях (CE-SDS), например, как в примере 5. В одном варианте осуществления LMWS содержит или состоит из «Пика 6» по данным CE-SDS (смотри, например, пример 5).

«Разновидности с высокой молекулярной массой » или «HMWS» включают препарат пертузумаба, имеющий молекулярную массу, которая превышает молекулярную массу основных видов или интактного пертузумаба (например, где интактный пертузумаб имеет молекулярную массу примерно 145197 Да, измеряя только его пептидные цепи). HMWS можно обнаружить с помощью эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC) и/или капиллярного электрофореза с додецилсульфатом натрия в нередуцирующлх условиях (CE-SDS), например, как в примере 5.

«Пик 1» в настоящем описании относится к фрагменту (фрагментам) пертузумаба, размер которых меньше размера легкой цепи пертузумаба (LC). Фрагменты) Пика 1 могут быть отделены от основных видов пертузумаба с помощью CE-SDS, предпочтительно с помощью CE-SDS (R-CE-SDS) в редуцирующих условиях. Смотри, например, фиг. 33В, таблицу 16 и таблицу 18 в настоящем описании. Предпочтительно, величина пика 1 в композиции пертузумаба составляет ≤0,5%. Необязательно, R-CE-SDS анализ проводят, как описано в примере 6, и соответствующая площадь пика (CPA) дает % пика 1 в композиции.

«Пик 2» в настоящем изобретении относится к фрагменту (фрагментам) пертузумаба, размер которых больше легкой цепи пертузумаба (LC) и меньше негликозилированной тяжелой цепи пертузумаба (NGHC). Пик 2 можно отделить от основных видов пертузумаба с помощью CE-SDS, предпочтительно, с помощью анализа в редуцирующих условиях (R-CE-SDS). Пик 2 исключает пик 3, который может появиться во время анализа R-CE-SDS, как объясняется в примере 6 в настоящем описании. Смотри, например, фиг. 33В, таблицу 16 и таблицу 18 в настоящем описании. Предпочтительно, величина пика 2 в композиции пертузумаба составляет ≤1,0%. Необязательно, анализ R-CE-SDS проводят, как описано в примере 6, и скорректированная площадь пика (CPA) дает % пика 2 в композиции.

«Фрагментация» относится к расщеплению полипептидной цепи, например, к расщеплению легкой цепи и/или тяжелой цепи пертузумаба. Фрагментация не включает диссоциацию нековалентно соединенных полипептидных цепей, например, во время NR CE-SDS анализа.

«Аналитическое исследование» представляет собой исследование, в котором количественно оценивают и/или количественно измеряют присутствие или количество аналита (например, варианта антитела) в композиции. Композиция, подвергающаяся такому исследованию, может быть очищенной композицией, в том числе, фармацевтической композицией.

«Хроматографический анализ Fab гидрофобного взаимодействия» или «анализ Fab HIC» включает получение фрагментов (например, Fab фрагментов) антител в композиции (например, используя фермент папаин) и проведение HIC полученных таким образом фрагментов антител для отделения вариантов с неспаренными цистеинами от основных видов пертузумаба. В качестве примера такой анализ раскрыт в примере 1 в настоящем описании.

«Рецептор HER» представляет собой рецепторную протеинтирозинкиназу, которая принадлежит семейству рецепторов HER, и включает рецепторы EGFR, HER2, HER3 и HER4 Рецептор HER в основном будет включать внеклеточный домен, который может связываться с лигандом HER и/или димеризоваться с другой рецепторной молекулой HER; липофильным трансмембранным доменом; консервативным внутриклеточным тирозинкиназным доменом; и карбоксил-концевым сигнальным доменом, содержащим несколько остатков тирозина, которые могут быть фосфорилированы.

Выражение «HER2» относится к белку HER2 человека, описанному, например, у Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) и Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986) (Genebank accession number X03363).

В настоящем описании «внеклеточный домен HER2» или «HER2 ECD» относится к домену HER2, который находится вне клетки, либо заякорен в клеточной мембране, либо находится в кровотоке, включая его фрагменты. Аминокислотная последовательность HER2 показана на Фиг. 1. В одном варианте осуществления внеклеточный домен HER2 может содержать четыре домена: «субдомен I» (аминокислотные остатки примерно от 1-195; SEQ ID ΝΟ:1), «субдомен II» (аминокислотные остатки примерно от 196-319; SEQ ID NO: 2), «субдомен III» (аминокислотные остатки примерно от 320-488: SEQ ID NO: 3) и «субдомен IV» (аминокислотные остатки примерно от 489-630; SEQ ID NO: 4) (нумерация остатков без сигнального пептида). Смотри Garrett et al. Mol Cell 11: 495-505 (2003), Cho et al Nature 421: 756-760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004), и Plowman et al. Proc. Natl Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993), а также Фиг. 1 в настоящем описании.

«Димер HER» в настоящем описании представляет собой нековалентно связанный димер, содержащий по меньшей мере два рецептора HER. Такие комплексы могут образовываться в тех случаях, когда клетка, экспрессирующая два или более рецепторов HER, подвергается воздействию лиганда HER, и может быть выделен с помощью иммунопреципитации и проанализирован с помощью SDS-PAGE, как описано, например, у Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994). Другие белки, такие как субъединица цитокинового рецептора (например, gp130) могут быть ассоциированы с димером. Предпочтительно, димер HER содержит HER2.

«Гетеродимер HER» в настоящем описании представляет собой нековалентно связанный гетеродимер, содержащий по меньшей мере два различных рецептора HER, например, гетеродимеры EGFR-HER2, HER2-HER3 или HER2-HER4.

«Активация HER» относится к активации или фосфорилированию любого одного или более рецепторов HER. В основном, активация HER в результате приводит к трансдукции сигнала (например, вызванной внутриклеточным киназным доменом рецептора HER, фосфорилирующего остатки тирозина в рецепторе HER или полипептиде субстрата). Активация HER может быть опосредована лигандом HER, связывающимся с димером HER, содержащим представляющий интерес рецептор HER. Лиганд HER, связывающийся с димером HER, может активировать киназный домен одного или более рецепторов HER в димере и, следовательно, в результате приводит к фосфорилированию остатков тирозина в одном или более рецепторах HER и/или к фосфорилированию остатков тирозина в дополнительных полипептидах субстрата, например, Akt или МАРК внутриклеточных киназах.

«Гуманизированные» формы антител, не являющихся антителами человека (например, грызунов) представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека. Главным образом, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента замещены остатками из гипервариабельной области видов, не являющихся человеком (донорное антитело), например, мыши, крысы, кролика или нечеловекообразного примата, обладающими желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека замещены соответствующими остатками иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которых нет в реципиентном антителе или в донорском антителе. Эти модификации сделаны для дальнейшего улучшения активности антител. В основном, гуманизированное антитело будет содержать по существу все по меньшей мере из одного и, обычно, двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют петлям иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека, и все или по существу все FR представляют собой каркасные области последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно, константной области иммуноглобулина человека. Дополнительные подробные сведения смотри у Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Гуманизированные антитела к HER2, в частности, включают трастузумаб и гуманизированные антитела 2С4, такие как пертузумаб, как описано и определено в настоящем описании.

«Интактное антитело» в настоящем описании представляет собой антитело, которое содержит две антигенсвязывающие области и область Fc. Предпочтительно, интактное антитело имеет функционально активную область Fc. В одном варианте осуществления «интактный пертузумаб» имеет молекулярную массу примерно 145197 Да, измеряя только его пептидные цепи.

Термин «гипервариабельная область» в контексте настоящего изобретения относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Гипервариабельная область в основном содержит аминокислотные остатки из «области, определяющей комплементарность» или «CDR» (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Остатки «каркасной области» или «FR» представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области, как определено в настоящем описании.

Термин «Fc область» в контексте настоящего изобретения используется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fc области нативной последовательности и Fc области варианта. Хотя границы Fc области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, Fc область тяжелой цепи IgG человека обычно определяется для фрагмента от аминокислотного остатка в положении Cys226, или от Рго230, до его карбоксильного конца. С-концевой лизин (остаток 449 в соответствии с системой нумерации EU) области Fc, может быть удален, например, во время продукции или очистки антитела, или путем рекомбинантной инженерии нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Соответственно, композиция интактных антител может содержать популяции антител со всеми удаленными остатками К449, популяции антител без удаленных остатков К449 и популяции антител, имеющих смесь антител с остатком К449 и без него.

Если не указано иное, в настоящем описании нумерация остатков в тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой нумерацию EU индекса как у Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), специально включено в настоящее описание в качестве ссылки. «EU индекс как у Kabat» относится к нумерации остатков антитела человека IgG1 EU.

«Функционально активная Fc область» обладает «эффекторной функцией» нативной последовательности области Fc. Приводимые в качестве примера «эффекторные функции» включают связывание с C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание с Fc рецептором; антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; отрицательную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора; BCR), и так далее. Для таких эффекторных функций в основном требуется, объединение Fc области со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела) и их можно оценить с использованием различных анализов.

«Нативная последовательность области Fc» включает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности природной области Fc. Нативная последовательность Fc областей антитела человека включает нативную последовательность Fc области IgG1 человека (не-А и А аллотипы); нативную последовательность Fc области IgG2 человека; нативную последовательность Fc области IgG3 человека; и нативную последовательность Fc области IgG4 человека, а также их природные варианты.

«Оголенное антитело» представляет собой антитело, которое не конъюгировано с гетерологичной молекулой, такой как цитотоксическая группа или радиоактивная метка.

Термин «основные виды антитела» или «антитело дикого типа» в настоящем списании относится к структуре аминокислотной последовательности антитела в композиции, которая представляет собой количественно преобладающую молекулу антитела в композиции. Предпочтительно, основными видами антитела является антитело к HER2, например, антитело, которое связывается с субдоменом II HER2, антитело, которое ингибирует димеризацию HER более эффективно, чем трастузумаб, и/или связывается с гетеродимерным сайтом связывания на HER2. В одном варианте осуществления основными видами антитела является антитело, содержащее CDR-H1 (SEQ ID NO: 17 или 23), CDR-H2 (SEQ ID NO: 18), и CDR-H3 (SEQ ID NO: 19), CDR-L1 (SEQ ID NO: 20), CDR-L2 (SEQ ID NO: 21 или 24) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 22), аминокислотные последовательности VL и VH в последовательностях SEQ ID NO, 7 и 8, соответственно (смотри фиг. 2А-2В), и, необязательно, аминокислотные последовательности легкой цепи в последовательностях SEQ ID NO. 11 или 15 и аминокислотные последовательности тяжелой цепи в последовательностях SEQ ID NO. 12 или 16 (смотри фиг. 3А-3В и 5А-5В). В одном варианте осуществления основными видами антитела является пертузумаб.

Антитело, которое «ингибирует димеризацию HER», представляет собой антитело, которое ингибирует или препятствует образованию димера или гетеродимера HER. В одном варианте осуществления такое антитело связывается с HER2 в его гетеродимерном сайте связывания. Наиболее предпочтительным антителом, ингибирующим димеризацию, в настоящем описании является пертузумаб.

«Гетеродимерный сайт связывания» на HER2, относится к области во внеклеточном домене HER2, которая контактирует или взаимодействует с областью во внеклеточном домене EGFR, HER3 или HER4 при образовании димера с помощью него. Эта область находится в субдомене II HER2 (SEQ ID NO: 2). Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004).

Антитело к HER2, которое «связывается с гетеродимерным сайтом связывания» HER2, связывается с остатками в субдомене II (SEQ ID NO: 2) и, необязательно, также связывается с другими остатками во внеклеточном домене HER2, например, субдомены I и III (SEQ ID NO: 1 и 3), и может пространственно затруднять, по меньшей мере до некоторой степени, образование гетеродимера HER2-EGFR, HER2-HER3 или HER2-HER4. Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004) характеризуют кристаллическую структуру HER2-пертузумаб, депонируемого в RCSB Protein Data Bank (ID Code IS78), иллюстрирующую приводимое в качестве примера антитело, которое связывается с гетеродимерным сайтом связывания HER2.

Антитело, которое «связывается с субдоменом II» HER2, связывается с остатками в субдомене II (SEQ ID NO: 2) и, необязательно, остатками в другом субдомен(ах) HER2, например, субдоменах I и III (SEQ ID NO: 1 и 3, соответственно).

Для целей настоящего описания «пертузумаб» и «rhuMAb 2С4», которые используются взаимозаменяемо, относятся к антителу, содержащему аминокислотные последовательности вариабельного домена легкой цепи (VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (VH) в SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно, фиг. 22 и 23 в настоящем описании иллюстрируют приводимые в качестве примера биологические функции пертузумаба. В тех случаях, когда пертузумаб представляет собой интактное антитело, он, предпочтительно, включает антитело IgG1; в одном варианте осуществления, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи в SEQ ID NO: 11 или 15, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи в SEQ ID NO: 12 или 16. Это антитело необязательно продуцируется рекомбинантными ооцитами китайского хомячка (СНО). Термины «пертузумаб» и «rhuMAb 2С4» в настоящем изобретении охватывают биологически сходные или предполагаемые копии лекарственного средства с наименованием по Справочнику национальных непатентованных названий США (USAN) или международным непатентованным наименованием (IΝΝ): пертузумаб.

Для целей настоящего изобретения «трастузумаб» и «rhuMAb4D5», которые используются взаимозаменяемо, относятся к антителу, включающему аминокислотные последовательности вариабельного домена легкой цепи (VL) и тяжелой цепи (VH) из SEQ ГО No: 13 и 14, соответственно (смотри фиг. 4А-4В). В тех случаях, когда трастузумаб представляет собой интактное антитело, он предпочтительно включает антитело lgG1; в одном варианте осуществления, включающий аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 13 и аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 14. Это антитело необязательно продуцируется ооцитами китайского хомячка (СНО). Термины «трастузумаб» и «rhuMAb4D5» в настоящем описании охватывают биологически сходные или предполагаемые копии лекарственного средства с наименованием по Справочнику национальных непатентованных названий США (USAN) или международным непатентованным наименованием (INN): трастузумаб.

«Вариант аминокислотной последовательности» антитела в настоящем описании представляет собой антитело с аминокислотной последовательностью, которая отличается от основных видов антитела. Обычно варианты аминокислотной последовательности будут обладать по меньшей мере примерно 70% гомологией с основными видами антитела, и, предпочтительно, они будут по меньшей мере примерно на 80%, и более предпочтительно, по меньшей мере примерно на 90% гомологичны основным видам антитела. Варианты аминокислотной последовательности имеют замены, делеции и/или добавления в определенных положениях внутри аминокислотной последовательности или смежно с аминокислотной последовательностью основных видов антитела. Примеры вариантов аминокислотной последовательности в настоящем описании включают дезамидированный вариант антитела, антитело с аминоконцевым лидерным удлинением (например, VHS-) на одном или двух его легких цепях, антитело с С-концевым остатком лизина на одном или двух его тяжелых цепях, и так далее, и включает сочетания изменений аминокислотных последовательностей тяжелой и/или легкой цепей.

«Кислый вариант» представляет собой вариант основных видов антитела, который является более кислым, чем основные виды антитела. Кислый вариант приобрел отрицательный заряд или утратил положительный заряд по сравнению с основными видами антитела. Такие кислые варианты можно разделить с использованием методики разделения, такой как ионообменная хроматография, которая разделяет белки в соответствии с зарядом. Кислые варианты основных видов антитела элюируют раньше основного пика при разделении с помощью катионообменной хроматографии.

«Вариант с восстановленным дисульфидом» имеет один или более межцепочечных дисульфид-связанных цистеинов, химически восстановленных до формы свободного тиола. Этот вариант можно подвергать мониторингу с помощью капиллярного электрофореза с додецилсульфатом натрия в нередуцирующих условиях (CE-SDS), например, как описано в WO 2009/099829 (Harris et al.).

В настоящем описании «невосстанавливаемый вариант» или «неполностью восстановленный вариант» представляет собой вариант основных видов антитела, который не может быть химически восстановлен до тяжелой цепи и легкой цепи обработкой восстанавливающим агентом, таким как дитиотреитол. Такие варианты можно определить с помощью обработки композиции восстанавливающим агентом и оценки полученной в результате композиции, используя методику, которая оценивает размер белка, например, капиллярным электрофорезом с додецилсульфатом натрия (CE-SDS), например, используя способы, описанные в WO 2009/099829 (Harris et al.).

«Вариант гликозилирования» антитела в настоящем описании представляет собой антитело с одной или более углеводными группами, присоединенными к нему, которые отличаются от одной или более углеводных групп, присоединенных к основным видам антитела. В одном варианте осуществления вариант гликозилирования имеет олигосахаридные структуры, присоединенные к одной или обеим тяжелым цепям антитела, например, у остатка 299 тяжелой цепи. В одном варианте осуществления основные виды антитела (например, пертузумаб) содержат олигосахарид G0 в качестве заданного олигосахарида, присоединенного к его Fc области. Приводимые в качестве примера олигосахаридные структуры, присоединенные к IgG1, изображены на фиг. 24А-24В. Примеры вариантов гликозилирования в настоящем изобретении включают вариант, лишенный фукозы, антитело с олигосахарид ной структурой G1 или G2, вместо олигосахаридной структуры G0, присоединенной к его Fc области («вариант гликозилирования G1» или «вариант гликозилирования G2»), антитело без углевода, присоединенного к одной или обеим тяжелым цепям антитела («вариант с негликозилированной тяжелой цепью»), сиалилированный вариант, и так далее, а также сочетания таких модификаций гликозилирования. Смотри, например, патент США 7560111 (Као et al.).

В тех случаях, когда антитело имеет Fc область, олигосахаридная структура может быть присоединена к одной или обеим тяжелым цепям антитела, например, у остатка 299. В одном варианте осуществления GO является преобладающей олигосахаридной структурой, с другими олигосахаридными структурами, такими как G0-F, G-1, Man5, Man6, G1-1, G1(1-6), G1(1-3) и G2 обнаруживаемыми в меньшем количестве в композиции.

Если не указано иное, «олигосахаридная структура G1» в настоящем описании включает структуры G1(1-6) и G1(1-3).

Для целей настоящего описания «сиалилированный вариант» представляет собой вариант основных видов антитела, содержащий одну или более сиалилированных углеводных групп, присоединенных к одной или двум его тяжелым цепям. Сиалилированный вариант может быть идентифицирован путем анализа композиции (например, с помощью ионобменной хроматографии) с обработкой сиалидазой или без нее, например, как описано в WO 2009/099829.

«Гликозилированный вариант» представляет собой антитело, к которому был ковалентно присоединен сахар, такой как глюкоза, например, к одной или обеим легким цепям антитела. Это добавление может возникать посредством взаимодействия глюкозы с остатком лизина на белке (например, в культуральной клеточной среде). Гликозилированный вариант может быть идентифицирован с помощью масс-спектрометрического анализа восстановленного антитела, определяя увеличение массы тяжелой или легкой цепи. Гликозилированный вариант также может быть определен количественно с помощью боронатной хроматографии, как описано в WO 2009/099829 (Harris et al.).

«Дезамидированное» антитело представляет собой антитело, в котором один или более остатков аспарагина образовывали производные, например, аспарагиновую кислоту, сукцинимид или изо-аспарагиновую кислоту. Примером дезамидированного антитела является вариант пертузумаба, в котором Asn-386 и/или Asn-391 на одной или двух тяжелых цепях пертузумаба являются дезамидированными. Смотри, например, WO 2009/099829 (Harris et al.).

«Вариант с аминоконцевым лидерным удлинением» в настоящем описании относится к основным видам антитела с одним или более аминокислотными остатками аминоконцевок лидерной последовательности на аминоконце любой одной или более тяжелой или легкой цепей антитела основных видов. Приводимое в качестве примера аминоконцевое лидерное удлинение содержит или состоит из трех аминокислотных остатков, VHS-, присутствующих на одной или обеих легких цепях варианта антитела, обозначенного в настоящем описании «VHS-вариант». Смотри патент США 7560111 (Као et al.).

«Вариант с С-концевым лизином» относится к варианту, содержащему остаток лизина (К) на С-конце его тяжелой цепи. Смотри патент США 7560111 (Као et al.).

«Вариант с окисленным метионином» относится к варианту, содержащему один или более окисленных остатков метионина, например, окисленный Met-254. Смотри патент США 7560111 (Као et al.).

Термин «злокачественное заболевание» относится к физиологическому состоянию у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры злокачественного заболевания в настоящем описании включают рак молочной железы (например, метастатический рак молочной железы), рак желудка (или живота), рак яичников, первичный перитонеальный рак и рак фаллопиевых труб. Примеры злокачественных заболеваний в настоящем описании включают HER2-позитивное злокачественное заболевание и злокачественное заболевание с низким уровнем HER3.

Злокачественная опухоль или биологический образец, который «демонстрирует экспрессию, амплификацию или активацию HER» представляет собой опухоль или образец, который в диагностическом тесте экспрессирует (в том числе, гиперэкспрессирует) рецептор HER, имеет амплифицированный ген HER и/или иным образом демонстрирует активацию или фосфорилирование рецептора HER.

«HER2-позитивная» злокачественная опухоль содержит злокачественные клетки, которые имеют более высокий уровень HER2 по сравнению с нормальными уровнями. Примеры HER2-позитивный злокачественной опухоли включают HER2-позитивный рак молочной железы и HER2-позитивный рак желудка. Способы идентификации HER2-позитивной злокачественной опухоли включают: исследования, в которых измеряют белок HER2, например, иммуногистохимический анализ (IHC), исследования, в которых определяют HER2-кодирующую нуклеиновую кислоту, например, гибридизация in situ (ISH), включая флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH; смотри WO 98/45479 опубликовано в октябре 1998) и хромогенную гибридизацию in situ (CISH; смотри, например, Tanner et al., Am. J. Pathol. 157(5): 1467-1472 (2000); Bella et al., J. Clin. Oncol. 26: (May 20 suppl; abstr 22147) (2008)), саузерн блоттинг или методики полимеразной цепной реакции (ПЦР), такие как количественная ПЦР в режиме реального времени (qRT-PCR); анализы слущивающегося антигена (например, HER2 ECD) (смотри, например, патент США 4933294, выданный 12 июня 1990; и патент США 5401638, выданный 28 марта 1995); и анализы in vivo. Необязательно, HER2-позитивная злокачественная опухоль имеет иммуногистохимический балл (IHC) 2+ или 3+ и/или амплификационное соотношение in situ гибридизации (ISH)≥2,0.

Злокачественная опухоль с «низким уровнем HER3» содержит злокачественные клетки, которые имеют более низкие уровни HER3 по сравнению с нормальными уровнями. Примеры злокачественных опухолей с низким уровнем НЕR3 включают рак яичников, первичный перитонеальный рак и карциному фаллопиевых труб. Смотри, например, патент США 7981418 (Amler et al.). В одном варианте осуществления низкий уровень HER3 определяется на основании уровней экспрессии мРНК HER3 (соотношение концентраций равно или ниже 2,81, по данным qRT-PCR на приборе COBAS z480®).

«Эпитоп 2С4» представляет собой область во внеклеточном домене HER2, с которой связывается антитело 2С4. Для скрининга антител, которые связываются по существу с эпитопом 2С4, можно провести рутинное исследование перекрестного связывания, например, описанное в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Предпочтительно, антитело блокирует связывание 2С4 с HER2 примерно на 50% или более. Альтернативно, можно провести картирование эпитопа, чтобы оценить, связывается ли антитело преимущественно с 2С4 эпитопом HER2. Эпитоп 2С4 содержит остатки из субдомена II (SEQ ID NO: 2) во внеклеточном домене HER2. 2С4 и пертузумаб связываются с внеклеточным доменом HER2 в сочетании с субдоменами I, II и III (SEQ ID NOs: 1, 2 и 3, соответственно). Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004).

«Лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическому лечению и профилактическим или превентивным мерам. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже страдает злокачественным заболеванием, а так же тех, у кого следует предотвратить злокачественное заболевание. Следовательно, у пациента, подлежащего лечению, в настоящем описании может быть диагностировано наличие злокачественного заболевания или пациент может быть предрасположен к злокачественному заболевании) или восприимчив к нему.

Термин «эффективное количество» относится к количеству лекарственного средства, эффективному для лечения злокачественного заболевания у пациента. Эффективное количество лекарственного средства может уменьшать число злокачественных клеток; уменьшать размер опухоли; ингибировать (то есть замедлять до некоторой степени и, предпочтительно, останавливать) инфильтрацию злокачественных клеток в периферические органы; ингибировать (то есть замедлять до некоторой степени и, предпочтительно, останавливать) метастазирование опухоли; ингибировать, до некоторой степени, опухолевой рост; и/или облегчать до некоторой степени один или более симптомов, связанных со злокачественным заболеванием. В той степени, в которой лекарственное средство может предотвращать рост и/или уничтожать существующие злокачественные клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. Эффективное количество может продлевать выживание без прогрессирования заболевания (например, по данным Критерия оценки ответа при солидных опухолях, RECIST, или изменения СА-125), в результате приводя к объективному ответу (включая частичный ответ, PR, или полный ответ, CR), увеличению времени общей выживаемости и/или облегчения одного или более симптомов злокачественного заболевания (например, по оценке FOSI).

«Фиксированная» или «постоянная» доза терапевтического средства в настоящем описании относится к дозе, которую вводят человеку пациенту независимо от массы тела (WT) или площади поверхности тела (BSA) пациента. Фиксированную или постоянную дозу, следовательно, не представляют в виде дозы мг/кг или дозы мг/м², а в виде абсолютного количества терапевтического средства.

«Контейнер» относится к изделию, которое может быть использовано для хранения или содержания фармацевтической композиции или композиции. Примеры контейнеров в настоящем описании включают флакон, шприц, внутривенный мешок и так далее.

«Внутривенный мешок» или «ВВ мешок» представляет собой мешок, который может содержать раствор, который можно вводить через вену пациента. В одном варианте осуществления раствор представляет собой физиологический раствор (например, примерно 0,9% или примерно 0,45% NaCl). Необязательно, ВВ мешок получают из полиолефина или поливинилхлорида.

«Флакон» представляет собой контейнер, подходящий для хранения жидкого или лиофилизированного препарата. В одном варианте осуществления флакон представляет собой одноразовый флакон, например, 20-сс одноразовый флакон с пробкой.

«Лист-вкладыш» представляет собой информационный листок, который по требованию Управления по контролю качества продуктов питания и лекарственных средств (FDA) или другого регулирующего органа, должен быть размещен внутри упаковки каждого лекарственного средства рецептурного отпуска. Информационный листок обычно включает товарный знак лекарственного средства, его непатентованное название и механизм действия; указывает показания, противопоказания, предупреждения, предостережения, побочные эффекты и лекарственные формы, и содержит инструкции в отношении рекомендованной дозы, времени и пути введения.

«Фармацевтическая композиция» представляет собой композицию, содержащую фармацевтически активное лекарственное средство (например, пертузумаб и формы вариантов, например, те, которые описаны в настоящем изобретении) и один или более «фармацевтически активных эксципиентов» (например, буфер, стабилизатор, модификатор тоничности, консервант, поверхностно-активное вещество и так далее), которую можно безопасно вводить человеку пациенту. Такие композиции могут быть, например, жидкими или лиофилизированными.

«Рекомбинантный» белок представляет собой белок, который был продуцирован генетически модифицированной клеткой-хозяином, например, такой клеткой-хозяином, как ооцит китайского хомячка (СНО).

«Промышленный масштаб» относится к продукции белкового лекарственного средства (например, антитела) в коммерческом масштабе, например, 12000 литров (L) или более ç использованием промышленного способа, одобренного FDA или другим регулирующим органом.

«Очищение» относится к одной или более стадиям очистки, таким как хроматография с белком А, ионообменная хроматография, и так далее.

«Выделенный» вариант относится к варианту, который был отделен от антитела основных видов или антитела дикого типа с помощью одной или более методик очистки или аналитических способов. Такой выделенный вариант можно оценить на его биологическую активность и/или эффективность.

II. Композиции антител

(i) Основные виды антител

Антительные композиции в настоящем описании содержат антитело, которое связывается с HER2 (антитело к HER2), необязательно гуманизированное антитело к HER2. Гуманизированные антитела в настоящем описании, например, могут содержать остатки гипервариабельной области, не являющейся гипервариабельной областью антитела человека, встроенные в вариабельный домен тяжелой цепи анитела человека и могут дополнительно содержать замену в каркасной области (FR) в положении, выбранном из группы, состоящей из 69Н, 71H и 73Н, используя систему нумерации вариабельного домена, изложенную у Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). В одном варианте осуществления гуманизированное антитело содержит замены FR в двух или во всех положениях 69Н, 71H и 73Н.

Приводимое в качестве примера гуманизированное антитело, представляющее интерес, в настоящем изобретении содержит остатки VH CDR:

- GFTFTDYTMX (SEQ ID NO: 17), где X предпочтительно представляет собой D или S, например, GFTFTDYTMD (SEQ ID NO: 23) для CDR-H1;

- DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO: 18) для CDR-H2; и/или

- NLGPSFYFDY (SEQ ID NO: 19) для CDR-H3, необязательно содержащие аминокислотные модификации тех остатков CDR, например, в тех случаях, когда модификации по существу сохраняют или улучшают аффинность антитела. Например, вариант антитела для использования в способах по настоящему изобретению, может иметь примерно от одной примерно до семи или примерно пяти аминокислотных замен в указанных выше последовательностях CDR вариабельной области тяжелой цепи. Такие варианты антитела могут быть получены путем созревания аффинности, например, как описано ниже.

Гуманизированное антитело может содержать остатки VL CDR:

- KASQDVSIGVA (SEQ ID NO: 20) для CDR-L1;

- SASYX¹X²X³, где X¹ предпочтительно представляет собой R или L, X² предпочтительно представляет собой Y или Е, и X³ предпочтительно представляет собой Τ или S (SEQ ID NO: 21), например, SASYRYT (SEQ ID NO: 24) для CDR-L2; и/или

- QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 22) для CDR-L3,

например, например, при добавлении к этим остаткам CDR вариабельного домена тяжелой цепи в предыдущем абзаце.

Такие гуманизированные антитела необязательно содержат аминокислотные модификации указанных выше остатков CDR, например, в тех случаях, когда модификации по существу сохраняют или улучшают аффинность антитела. Например, вариант антитела, представляющий интерес, может иметь примерно от одной примерно до семи или примерно до пяти аминокислотных замен в указанных выше последовательностях CDR вариабельного домена легкой цепи. Такие варианты антитела могут быть получены путем созревания аффинности.

В настоящей заявке также рассматриваются аффинно зрелые антитела, которые связываются с HER2. Исходное антитело может представлять собой антитело человека или гуманизированное антитело, например, антитело, содержащее последовательности SEQ ID NO. 7 и 8 вариабельной области легкой цепи и/или вариабельной области тяжелой цепи, соответственно (то есть, содержащее VL и/или VH пертузумаба). Аффинно зрелый вариант пертузумаба предпочтительно связывается с рецептором HER2 с аффинностью, превышающей аффинность мышиного 2С4 или пертузумаба (например, примерно от двух или примерно от четырех раз примерно до 100 раз или примерно до 1000 раз улучшенной аффинностью, например, по оценке с использованием HER2 ECD ELISA). Приводимые в качестве примера остатки CDR вариабельной области тяжелой цепи для замещения включают Н28, Н30, Н34, Н35, Н64, Н96, Н99 или сочетания двух или более (например, двух, трех, четырех, пяти, шести или семи этих остатков). Примеры остатков CDR вариабельной области легкой цепи включают L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 или сочетания двух или более (например, от двух до трех, четырех, пяти или примерно вплоть до десяти таких остатков).

Рассматриваются различные формы гуманизированного антитела или аффинно зрелого антитела. Например, гуманизированное антитело или аффинно зрелое антитело. Альтернативно, гуманизированное антитело или аффинно зрелое антитело может представлять собой интактное антитело, такое как интактное антитело IgG1.

Предпочтительно, антитело к HER2 (любое из двух или оба антитела основных видов к HER2 и вариант антитела) представляет собой антитело, которое связывается с субдоменом II HER2, ингибирует димеризацию HER более эффективно, чем трастузумаб и/или связывается с гетеродимерным сайтом связывания HER2. Предпочтительный вариант осуществления основных видов антитела в настоящем описании представляет собой вариант, содержащий аминокислотные последовательности в SEQ ID No. 3 и 4 вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи, и, наиболее предпочтительно, содержащее аминокислотную последовательность в SEQ ID No. 11 или 15 легкой цепи и аминокислотную последовательность в SEQ ID No. 12 или 16 тяжелой цепи.

(ii) Варианты с неспаренными цистеинами

В настоящем описании в примерах 1 и 3 описаны варианты пертузумаба с неспаренными цистеинами. Аналитические исследования по выделению, характеристике и количественной оценке таких вариантов включают исследования, в которых специфически определяют внутрицепочечные дисульфидные связи (как отличные от межцепочечных дисульфидных связей), например, хроматографический анализ гидрофобных взаимодействий (HIC) фрагментов антитела (например, Fab фрагмента) как в примере 1, HIC интактного антитела как в примере 1, анализ пептидного картирования дифференциально меченых антител как в примере 3, и/или высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой (RP-HPLC) как в примере 3 в настоящем описании и у Zhang et al. Anal. Chem. 84(16):7112-7123 (2012).

В основном, преобладающая форма пертузумаба содержит дисульфидную связь между Cys23 и Cys88 в обоих VL доменах двух его доменов Fab. Смотри фиг. 6.

Один вариант с неспаренными цистеинами в настоящем описании, гетеродимерный вариант, лишен дисульфидной связи Cys23/Cys88 в вариабельном домене легкой цепи (VL) только одной из двух его областей Fab. Смотри Фиг. 20(b). Было определено, что это является преобладающим вариантом с неспаренными цистеинами.

В настоящем описании дополнительный вариант с неспаренными цистеинами, гомодимерный вариант, лишен дисульфидных связей Cys23/Cys88 в обеих областях Fab. Смотри Фиг. 20(c).

В одном варианте осуществления содержание варианта с неспаренными цистеинами в композиции (включая гомодимерный и гетеродимерный вариант) составляет ≤ примерно 25%, например, по данным хроматографии Fab с гидрофобным взаимодействием (HIC).

В одном варианте осуществления содержание гомодимерного варианта в композиции составляет ≤4,9%) по данным HIC интактного антитела.

В одном варианте осуществления содержание гетеродимерного варианта в композиции составляет примерно от 13% примерно до 18%, например, по данным HIC интактного антитела.

Композиция необязательно дополнительно содержит один или более дополнительных вариантов, как описано ниже.

Настоящее изобретение также относится к выделенному варианту с неспаренными цистеинами пертузумаба, где вариант с неспаренными цистеинами содержит Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба. Такой выделенный вариант с неспаренными цистеинами может содержать или состоять из гетеродимерного варианта и/или гомодимерного варианта. Такие варианты могут быть выделены с использованием HIC или других способов очистки, и могут подвергаться биологическому анализу, такому как анализ эффективности (используя HER2-позитивные клетки злокачественной опухоли молочной железы) как в примере 1, приведенном ниже.

(iii) Вариант, лишенный фукозы

В настоящем описании в примерах 2 и 4 описаны варианты пертузумаба, лишенные фукозы, и продемонстрировано, как определить ADCC активность, исходя из процента пертузумаба, лишенного фукозы, в композиции.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей пертузумаб и вариант пертузумаба, лишенный фукозы, где количество варианта, лишенного фукозы, составляет более 2% композиции. Смотри, например, анти2С4907-2, и Серию 1 в таблице 9, приведенной ниже.

В альтернативном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей пертузумаб и вариант пертузумаба, лишенный фукозы, где количество варианта, лишенного фукозы, составляет от 0,9 до 4,1% композиции. Это количество варианта, лишенного фукозы, может, например, быть определено количественно, используя утвержденный анализ CE-LIF в примере 4.

Необязательно, композиция дополнительно содержит варианты с неспаренными цистеинами (гетеродимер и/или гомодимер, как описано в предыдущем разделе) и/или дополнительные варианты, описанные ниже.

(iv) LMWS и HMWS

Настоящее изобретение дополнительно относится к разновидностям пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS) и/или разновидности пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS) либо в выделенной форме, либо в композиции, содержащей такой вариант(ы) и основные виды антитела. LMWS и HMWS могут быть выделены, охарактеризованы и количественно проанализированы с использованием различных методик, включающих, без ограничения, эксклюзионную высокоэффективную жидкостную хроматографию (SE-HPLC) и/или капиллярный электрофорез с додецилсульфатом натрия (CE-SDS).

Используя SE-HPLC анализ (например, как в примере 5), количество основных видов пертузумаба и HMWS или LMWS в композиции может составлять:

Основной пик: ≥ примерно 96%, например ≥ примерно 96,7%, ≥ примерно 97,3%, например ≥ примерно 97,4%.

HMWS: ≤ примерно 2%, например ≤ примерно 1,7%, например ≤ примерно 1,5%, например ≤ примерно 1,4%, например ≤ примерно 0,8%).

LMWS: ≤ примерно 2%, например ≤ примерно 1,6%, например ≤ примерно 1,2%, например ≤ примерно 0,6%.

Используя NR-CE-SDS анализ (например, как в примере 5), количество основных видов пертузумаба и HMWS или LMWS в композиции может составлять:

Основной пик: ≥ примерно 95%, например ≥ примерно 96,0%, например ≥ примерно 97,8%)

HMWS: ≤ примерно 1%, например ≤ примерно 0,6%).

LMWS: ≤ примерно 4%, например ≤ примерно 3,4%.

Например, величина основного пика или количество основных видов пертузумаба (за исключением LMWS и HMWS) по данным CE-SDS может составлять примерно от 95% примерно до 99%, например, примерно от 96,0% примерно до 97,8%, например, примерно от 95,3% примерно до 97,3% основного пика.

Необязательно, LMWS содержит или состоит из «Пика 6», полученного с использованием NR-CE-SDS (смотри, например, пример 5). Определено, что такой Пик 6 может составлять примерно от 0,9% примерно до 2,3%, например, примерно от 2% примерно до 2,3% композиции.

(v) Фрагменты пертузумаба Пик 1 и Пик 2

Настоящее изобретение дополнительно относится к фрагменту (фрагментам) пертузумаба Пик 1 и/или фрагментам пертузумаба Пик 2 либо в отдельной, либо выделенной форме или в композициях, содержащих эти фрагмент(ы) и основные виды антитела. Пик 1 и Пик 2 могут быть выделены, охарактеризованы и количественно проанализированы с использованием различных способов, включающих, без ограничения, эксклюзионную высокоэффективную жидкостную хроматографию (SE-HPLC) и/или капиллярный электрофорез с додецилсульфатом натрия (CE-SDS), включая R-CE-SDS и NR-CE-SDS. В одном варианте осуществления Пик 1 и Пик 2 разделены и/или проанализированы с использованием R-CE-SDS, например, как описано в примерах 5 и 6 и скорректированная площадь пика (CPA) дает % Пика 1 или Пика 2 в композиции.

Используя R-CE-SDS анализ (например, как в примерах 5 и 6), количество Пика 1 в композиции составляет ≤5% (например, от 0,13% до 0,41%) CPA), а количество Пика 2 в композиции составляет ≤1,0% (например, от 0,47% до 0,74% CPA).

(vi) Дополнительные варианты

Композиции по настоящему изобретению необязательно содержат дополнительные варианты пертузумаба, например, описанные в патенте США 7560111 (Као et al.) и/или в WO 2009/099829 (Harris et al.).

Примеры таких дополнительных вариантов включают, без ограничения, любой один вариант или более: гликозилированный вариант, вариант с восстановленным дисульфидом, невосстанавливаемый вариант, дезамидированный вариант, сиалилированный вариант, VHS-вариант, вариант с С-концевым лизином, вариант с окисленным метионином, вариант, лишенный фукозы, вариант гликозилирования G1, вариант гликозилирования G2 и вариант с негликозилированной тяжелой цепью.

Например, композиция может содержать кислые варианты (смотри WO 2009/099829, Harris et al.), где кислые варианты в композиции могут включать один, два, три, четыре или пять из следующего: гликозилированный вариант, дезамидированный вариант, вариант с восстановленным дисульфидом, сиалилированный вариант и невосстанавливаемый вариант. Предпочтительно, общее количество всех кислых вариантов в композиции составляет примерно менее 25%. В одном варианте осуществления гликозилированный вариант, дезамидированный вариант, вариант с восстановленным дисульфидом, сиалилированный вариант и невосстанавливаемый вариант составляют по меньшей мере примерно 75-80% кислых вариантов в композиции.

Кислые варианты могут быть исследованы целым рядом способов, но. предпочтительно, такие способы включают один, два, три, четыре или пять из следующего: ионообменную хроматографию (IEC), при которой композицию обрабатывают сиалидазой до, после и/или во время EEC (например, для определения сиалилированного варианта), CE-SDS в редуцирующих условиях (например, для определения варианта с восстановленным дисульфидом), CE-SDS в нередуцирующих условиях (например, для определения невосстанавливаемого варианта), боронатную хроматографию (например, для определения гликозилированного варианта) и пептидное картирование (например, для определения дезамидированного варианта).

Композиция необязательно включает вариант с аминоконцевым лидерным удлинением. Предпочтительно, аминоконцевое лидерное удлинение представляет собой вариант легкой цепи антитела (например, на одной или двух легких цепях варианта антитела). Вариант антитела по настоящему изобретению может содержать аминоконцевое лидерное удлинение на любой одной или более его тяжелой или легкой цепи. Предпочтительно, аминоконцевое лидерное удлинение находится на одной или двух легких цепях антитела. Аминоконцевое лидерное удлинение, предпочтительно, содержит или состоит из VHS- (то есть VHS-вариант). Присутствие аминоконцевого лидерного удлинения в композиции можно обнаружить с помощью различных аналитических способов, включающих, но не ограничивающихся указанными, анализ N-концевой последовательности, анализ неоднородности заряда (например, катионообменная хроматография или капиллярно-зональный электрофорез), масс-спектрометрию, и так далее. Количество варианта антитела в композиции в основном находится в интервале от количества, которое составляет нижний предел обнаружения любого анализа (предпочтительно, катионообменного анализа), используемого для обнаружения этого варианта, до количества, меньшего, чем количество основных видов антитела. В основном, примерно 20% или менее (например, примерно от 1% примерно до 15%), например, от 5% примерно до 15%, и, предпочтительно, примерно от 8% примерно до 12%) молекул антитела в композиции содержат аминоконцевое лидерное удлинение. Такие процентные значения предпочтительно определяют, используя катионообменный анализ.

Рассматриваются дополнительные изменения аминокислотной последовательности основных видов антитела и/или варианта, в том числе, но не только, антитело, содержащее С-концевой остаток лизина на одной или обеих тяжелых цепях (например, такой вариант антитела может находиться в количестве примерно от 1% примерно до 20%), антитело с одним или более окисленными остатками метионина (например, пертузумаб, содержащий окисленный Met-254), и так далее.

Кроме того, помимо варианта, лишенного фукозы, и сиалилированного варианта, рассмотренного выше, основные виды антитела или вариант могут содержать дополнительные варианты гликозилирования, неограничивающие примеры которых включают антитело, содержащее G1 или G2 олигосахаридную структуру, присоединенную к его Fc области, антитело, содержащее одну или две негликозилированные тяжелые цепи, и так далее.

III. Способы получения и анализа

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения предложен способ оценки композиции пертузумаба, который включает одно, два, три или четыре из следующего: (1) измерение количества варианта с неспаренными цистеинами в композиции, где указанный вариант с неспаренными цистеинами содержит Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба, и/или (2) измерение количества пертузумаба, лишенного фукозы, в композиции, и/или (3) измерение количества разновидностей пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS) в композиции, и/или (4) измерение количества разновидностей пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS) в композиции. Необязательно, все четыре аналитических исследования проводят в отношении композиции, содержащей пертузумаб и его варианты.

Настоящее изобретение также относится к способу получения композиции, включающему: (1) получение композиции, содержащей пертузумаб и один или более его вариантов и (2) проведение одного или более аналитических исследований полученной таким образом композиции для определения в ней количества вариантов. В аналитическом исследовании (исследованиях) можно определить и измерить количество одного, или более из следующего: (i) варианта с неспаренными цистеинами, содержащего Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба и/или (ii) гетеродимерного варианта, содержащего Cys23/Cys88 неспаренные цистеины только в одном вариабельном домене легкой цепи пертузумаба и/или (iii) гомодимерного варианта, содержащего Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба и/или (iv) варианта пертузумаба, лишенного фукозы и/или (v) разновидностей пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS) и/или (vi) разновидностей пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS), и/или (vii) фрагмента(ов) пертузумаба Пика 1 и/или (viii) фрагмента(ов) пертузумаба Пика 2. Таким образом, можно проанализировать один, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь таких вариантов.

Необязательно, в аналитическом исследовании оценивается, определяется количество или выделяется вариант с неспаренными цистеинами, в том числе, гетеродимерные и/или гомодимерные варианты. Например, аналитическое исследование может включать хроматографию гидрофобных взаимодействий (HIC) фрагмента антитела (например, Fab фрагмента) или интактного антитела (смотри, например, пример 1), пептидное картирование (смотри, например, пример 3), или высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой (HPLC) (смотри, например, пример 3).

В одном варианте осуществления количество варианта с неспаренными цистеинами (гетеродимерный и/или гомодимерный вариант) в композиции составляет ≤ примерно 25% по данным хроматографии Fab с гидрофобным взаимодействием (HIC).

В одном варианте осуществления количество гомодимерного варианта в композиции составляет ≤4,9% по данным хроматография с гидрофобным взаимодействием (HIC) интактного антитела.

В одном варианте осуществления количество гетеродимерного варианта в композиции составляет примерно от 13% примерно до 18% по данным хроматография с гидрофобным взаимодействием (HIC) интактного антитела.

Необязательно, в аналитическом исследовании оценивается, определяется количество или выделяется вариант, лишенный фукозы. Величина дефукозилирования может быть использована для определения или количественной оценки биологической активности композиции, например ADCC.

Кроме того, этот способ включает оценку биологической активности композиции пертузумаба, включающую измерение в композиции количества варианта пертузумаба, лишенного фукозы, для определения антителозависимой клеточной цитотоксичной (ADCC) активности композиции, и подтверждение того, что количество пертузумаба, лишенного фукозы, находится в диапазоне примерно от 0,9% примерно до 4,1%. Например, этот способ включает измерение количества пертузумаба, лишенного фукозы, используя капиллярный электрофорез с лазерно-индуцированной флуоресценцией (CE-LIF).

Необязательно, аналитическим исследованием для оценки величины дефукозилирования является капиллярный электрофорез (СЕ), в том числе, капиллярный электрофорез с лазерно-индуцированной флуоресценцией (CE-LIF), смотри, примеры 2 и 4, представленные ниже. Количество варианта, лишенного фукозы, необязательно составляет примерно от 0,9 примерно до 4,1% композиции (например, по данным CE-LIF в примере 4). В одном варианте осуществления количество варианта, лишенного фукозы, превышает 2% композиции (например, по данным CE-LIF в примере 4).

Необязательно, в аналитическом исследовании оценивается, определяется количество или выделяются разновидности с низкой молекулярной массой (LMWS) и/или разновидности пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS). Приводимые в качестве примерз исследования включают SE-HPLC и/или CE-SDS (смотри, например, пример 5, приведенный ниже).

В одном варианте осуществления аналитическое исследование включает SE-HPLC (например, как в примере 5), и количество основных видов пертузумаба, HMWS или LMWS в композиции, проанализированной таким образом, составляет:

Основной пик: ≥ примерно 96%, например ≥ примерно 96,7%, ≥ примерно 97,3%, например ≥ примерно 97,4%

HMWS: ≤ примерно 2%, например ≤ примерно 1,7%), например, ≤ примерно 1,5%, например ≤ примерно 1,4%, например ≤ примерно 0,8%.

LMWS: ≤ примерно 2%, например ≤ примерно 1,6%, например ≤ примерно 1,2%, например ≤ примерно 0,6%.

В одном варианте осуществления аналитическое исследование включает CE-SDS (например, как в примере 5), и количество основных видов пертузумаба и HMWS или LMWS пертузумаба в композиции проанализированной таким образом, составляет:

Основной пик: ≥ примерно 95%, например ≥ примерно 96,0%, например ≥ примерно 97,8%

HMWS: ≤ примерно 1%, например ≤ примерно 0,6%.

LMWS: ≤ примерно 4%, например ≤ примерно 3,4%.

В одном варианте осуществления композицию анализируют, используя NR-CE-SDS, и величина основного пика или количество основных видов пертузумаба (за исключением LMWS и HMWS) составляет примерно от 95% примерно до 99%, например, примерно от 96,0% примерно до 97,8%, например примерно от 95,3% примерно до 97,3%) композиции, проанализированной таким образом.

В одном варианте осуществления величина «Пика 6» в композиции определяется с помощью CE-SDS (смотри, например, пример 5), и величина Пика 6 LMWS составляет примерно от 0,9% примерно до 2,3%, например, примерно от 2% примерно до 2,3% композиции, проанализированной таким образом.

В одном варианте осуществления величину Пика 1 и/или Пика 2 в композиции определяют с помощью R-CE-SDS (смотри, например, примеры 5 и 6), и количество Пика 1 составляет ≤5% (например, от 0,13%) до 0,41%) CPA) и количество Пика 2 составляет ≤1,0% (например, от 0,47% до 0,74% CPA).

Эти способы необязательно дополнительно включают объединение очищенной композиции с одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами для получения фармацевтической композиции. Кроме того, фармацевтическая композиция может быть помещена в контейнер, который упакован вместе с листком-вкладышем (например, с инструкциями по медицинскому применению препарата, информирующими пользователя о применении данной фармацевтической композиции для лечения злокачественного заболевания), таким образом, чтобы получить изделие.

IV. Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции, содержащие пертузумаб и его варианты, получают для хранения путем смешивания этой композиции, имеющей желаемую степень чистоты, с произвольными фармацевтически приемлемыми эксципиентами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в основном в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Также рассматриваются кристаллы антител (смотри патентную заявку США 2002/0136719). Фармацевтически приемлемые эксципиенты являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, и включают буферы, такие как гистидинацетат; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; полипептиды с низкой молекулярной массой (примерно менее 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества такие как полисорбаты (например, полисорбат 20 или 80), PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).

Лиофилизированные составы антител описаны в патенте США 6267958, в патенте США 6685940 и в патенте США 6821515, специально включенных в настоящее описание посредством ссылки. Приводимая в качестве примера фармацевтическая композиция трастузумаба представляет собой стерильный лиофилизированный порошок без консервантов, от белого до бледно-желтого цвета, для внутривенного (ВВ) введения, содержащий 440 мг трастузумаба, 400 мг дегидрата α,α-трегалозы, 9,9 мг L-гистидин-HCl, 6,4 мг L-гистидина и 1,8 мг полисорбата 20. Разведение 20 мл бактериостатической воды для инъекции (BWH). содержащей 1,1% бензилового спирта в качестве консерванта, дает в результате раствор многократных доз, содержащий 21 мг/мл трастузумаба с рН приблизительно 6,0.

Приводимая в качестве примера фармацевтическая композиция пертузумаба для терапевтического применения содержит 30 мг/мл пертузумаба в 20 мМ гистидинацетате, 120 мМ сахарозы, 0,02% полисорбата 20, с рН 6,0. Альтернативный состав пертузумаба содержит 25 мг/мл пертузумаба, 10 мМ гистидин-HCl буфера, 240 мМ сахарозы, 0,02% полисорбата 20, рН 6,0.

Фармацевтические композиции, используемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко осуществляется фильтрованием через стерильные фильтровальные мембраны.

V. Применение в терапевтических целях и использование

Композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения злокачественного заболевания, например, HER2-позитивного рака молочной железы, например, метастазирующего или местно рецидивирующего, неоперабельного рака молочной железы или IV стадии заболевания de novo, определяемого гистохимически (IHC) как 3+ и/или амплификационным соотношением флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) ≥2,0. Необязательно, пациенты в популяции ранее не получали лечения или имеют рецидив после адъювантной терапии, у которых фракция выброса левого желудочка (LVEF) ≥50% от исходного уровня, и/или имеют показатель общего состояния по шкале Восточной объединенной онкологической группы (ECOG PS) 0 или 1.

В альтернативном варианте осуществления композиция может быть использована для лечения ранней стадии HER2-позитивного рака молочной железы, например, в комбинации с трастузумабом и химиотерапией, где химиотерапия включает химиотерапию на основе антрациклина или химиотерапию на основе карбоплатина. В одном варианте осуществления химиотерапия включает химиотерапию на основе антрациклина, например, содержащего 5-FU, эпирубицин и циклофосфамид (FEC). В альтернативном варианте осуществления химиотерапия включает химиотерапию на основе карбоплатина, например, содержащую таксан (например, доцетаксел), карбоплатин в дополнение к HERCEPTIN®/Трастузумаб (например, режим ТСН). В одном варианте осуществления композицию вводят одновременно с химиотерапией на основе антрациклина или с химиотерапией на основе карбоплатина, например, где пертузумаб, трастузумаб и химиотерапию вводят в 3 недельных циклах с пертузумабом, трастузумабом и химиотерапию вводят в 1 день каждого цикла. Лечение ранней стадии HER2-позитивного рака молочной железы, рассматриваемое в настоящем описании, включает неоадъювантную и адъювантную терапию.

Еще в одном варианте осуществления композиция может быть использована для лечения HER2-позитивного рака желудка, необязательно в комбинации с трастузумабом и химиотерапией, такой как платин (например, цисплатин) и/или а фторпуримидин (например, капецитабин и/или 5-фторурацил (5-FU)).

В альтернативном варианте осуществления композиция может быть использована для лечения HER2-позитивного рака молочной железы, необязательно в комбинации ç трастузумабом и винорелбином. Рак молочной железы в соответствии с этим вариантом осуществления необязательно является метастатическим или местно распространенным. Необязательно, пациент ранее не получал системного негормонального противоопухолевого лечения в режиме лечения метастатических форм.

В другом аспекте композицию используют для лечения HER2-позитивного рака молочной железы у пациента, включающего введение пациенту этой композиции, трастузумаба и ингибитора ароматазы (например, анастразола или летрозола). В соответствии с этим вариантом осуществления рак молочной железы представляет собой распространенный рак молочной железы, рак молочной железы с позитивным гормональным рецептором, например, позитивный по рецептору эстрогена (ER) и/или позитивный по рецептору прогестерона (PgR) рак молочной железы. Необязательно, пациент ранее не получал системного негормонального противоопухолевого лечения в режиме лечения метастатических форм. Этот способ лечения необязательно дополнительно включает применение у пациента индукционной химиотерапии (например, содержащей таксан).

В дополнительном аспекте композицию используют для лечения злокачественного заболевания с низким уровнем HER3, например, рака яичников, первичного перитонеального рака или рака фаллопиевых труб. Смотри, например, патент США 7981418 (Amler et al.) и патентную публикацию США US-2006-0013819-A1 (Kelsey, S.).

Антитела и химиотерапевтическое лечение назначают человеку пациенту в соответствии с известными способами. Конкретные схемы лечения и составы описаны в примерах в настоящем описании.

В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения вводят приблизительно 840 мг (насыщающая доза) пертузумаба с последующим введением одной или более доз приблизительно 420 мг (поддерживающая доза (дозы) пертузумаба. Поддерживающие дозы предпочтительно вводят примерно каждые 3 недели, всего по меньшей мере две дозы, до клинического прогрессирования заболевания или трудноконтролируемой токсичности, например, от 6 до 20 доз. Также рассматриваются более длительные периоды лечения, включающие больше циклов лечения.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления, в котором злокачественное заболевание представляет собой рак желудка, пертузумаб вводят в дозе 840 мг для всех циклов лечения.

VI. Изделия

В одном варианте осуществления изделие в настоящем изобретении содержит контейнер, такой как флакон, шприц или внутривенный (ВВ) мешок, содержащий композицию или фармацевтическую композицию. Необязательно, изделие дополнительно содержит лист-вкладыш с указаниями по применению препарата, описывающими как применять композицию в соответствии с предыдущим разделом настоящего описания.

VII. Депонирование биологических материалов

Следующие гибридомные клеточные линии были депонированы Американской коллекцией типовых культур, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):

Обозначение антитела АТСС No. Дата депонирования 4D5 АТСС CRL 10463 24 мая 1990 2С4 АТСС НВ-12697 8 апреля 1999

Дополнительные подробные сведения об изобретении проиллюстрированы следующими неограничивающими примерами. Раскрытие всех ссылочных материалов в описании специально включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Пример 1

Вариант пертузумаба с неспаренными цистеинами Cys23/Cys88 и его характеристика

Пертузумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело (MAb) на основе каркасной области IgG1(κ) человека. Рекомбинантное антитело продуцируется ооцитами китайского хомячка (СНО) и содержит две тяжелые цепи (449 аминокислотных остатков) и две легкие цепи (214 аминокислотных остатков каждая) с межцепочечными и внутрицепочечными дисульфидными связями. Последовательности легкой цепи и последовательности тяжелой цепи пертузумаба показаны на фиг. 3А и 3В, соответственно. Рассчитанная молекулярная масса интактного пертузумаба составляет 145197 Да (только пептидные цепи без С-концевого остатка лизина в тяжелой цепи).

СН2 домен каждой тяжелой цепи также имеет один консервативный сайт гликозилирования в положении Asn299.

Пертузумаб отличается от трастузумаба (HERCEPTIN^®) областями, определяющими комплементарность (CDR) легкой цепи (12 аминокислотных отличий) и тяжелой цепи (29 аминокислотных отличий), и тем, что он связывается с другим эпитопом рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (p185^HER2). Связывание пертузумаба с рецептором HER2 на эпителиальных клетках человека препятствует образованию комплексов HER2 с другими представителями семейства HER рецепторов (в том числе EGFR, HER3, HER4) и образование гомодимеров HER2. Блокируя образование комплекса, пертузумаб ингибирует инициируемую лигандом передачу сигнала по двум основным сигнальным путям, митоген-активированной протеинкиназы (MAP) и фосфоинозитид 3-киназы (PI3K), приводя в результате к ингибированию пролиферации и выживания клетки, соответственно.

Этот пример относится к идентификации и характеристике варианта пертузумаба с неспаренными цистеинами: Cys23/Cys88 варианта с неспаренными цистеинами, содержащего неспаренные цистеины в одной или обеих легких цепях антитела.

Свободные сульфгидрилы определяли, используя реактив Эллмана, и было показано, что содержание реакционноспособных свободных сульфгидрильных групп составляет 0,1-0,3 моль на моль белка. Хроматографический анализ гидрофобных взаимодействий (HIC) и пептидное картирование выявил неспаренные остатки цистеина у Cys23 и Cys88 на одной или обеих легких цепях. Используя папаиновую HIC, было обнаружено, что уровни варианта Fab, содержащего свободные сульфгидрилы в этих участках, составляют 12,7%-13,5% в веществе пертузумаба, полученного с использованием коммерческих процессов производства. HIC анализ интактного антитела показал, что две основные формы составляют 78%-85% пертузумаба дикого типа и 13,4%-18,4% гетеродимерного пертузумаба (неспаренная цистеиновая пара на одном плече).

Материалы и методы

Тестируемые композиции: в этом примере описывается характеристика действующей партии стандартного образца пертузумаба анти2С4907-2 и Серия 1, представляющей клинический материал Фазы III, и пять Фаза III/коммерческие партии (Серии 3-7), все получены в масштабе 12000 литров (L), используя промышленный способ. Сравнение также проводят с предыдущей партией стандартного образца анти2С4-900-1, который является репрезентативным клиническим материалов Фазы Ι/II.

Тестируемые композиции представляли собой партии лекарственного вещества, полученного в виде коммерческого препарата с концентрацией 30 мг/мл в 20 мМ L-гистидинацетате, 120 мМ сахарозы и 0,02% (масс/об) полисорбата 20 с рН 6,0. Партия анти2С4-900-1 была получена ранее в клиническом испытании с концентрацией 25 мг/мл в 10 мМ L-гистидинхлорида, 240 мМ сахарозы и 0,02% (масс/об) полисорбата 20 с рН 6,0.

Анализ дисульфидной связи с использованием анализа пептидной карты в нередуцирующих условиях и масс-спектрометрии: для денатурации пертузумаба в нередуцирующих условиях и алкилирования любых замаскированных свободных сульфгидрильных групп, приблизительно 0,5 мг пертузумаба в рецептурном буфере перемешивали с денатурирующим буфером (состоящем из 8 M GdHCl, 10 мМ Ν-этилмалеимида (ΝΕΜ), 0,1 M ацетата натрия, рН 5,0), а затем инкубировали при 37°С в течение 3 часов. В этом растворе меняли буфер на 600 мкл 0,1 M Трис, 1 мМ CaCl₂, рН 7,0 используя колонки NAP-5. К каждому образцу добавляли ацетонитрил (ACN) до достижения концентрации 10%. Расщепление трипсином проводили при соотношении фермента к субстрату 1:10 (об/об) при 37°С в течение 16 часов. Полученные в результате пептиды разделяли с помощью RP-HPLC, используя способы, описанные ниже для сульфитолиза трипсиновых карт.

Сульфитолиз карт трипсиновых пептидов: для получения пептидных карт пертузумаба, белок расщепляли трипсином после восстановления и сульфитолиза остатков цистеина. Аликвоты (1 мг) пертузумаба добавляли к 360 мМ Трис-HCl рН 8,6, 6 M гуанидингидрохлорида (GdHCl), 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 13 мМ сульфата натрия и 38 мМ тетратионата натрия для восстановления и сульфитолиза остатков цистеина. Образцы инкубировали при 37°С в течение 20 минут. Сульфитолизированные образцы загружали на колонки PD-10 и элюировали с использованием 10 мМ Триса, 0,1 мМ CaCl₂, рН 8,3. После замены буферов добавляли 20 мкл 10% раствора октил-В-глюкозида и 20 мкл 1 мг/мл трипсина. Образцы инкубировали при 37°С в течение 5 часов. Реакцию расщепления гасили 25 мкл 10% трифторуксусной кислоты (TFA). Полученные в результате пептиды разделяли с помощью RP-HPLC, используя колонку Zorbax 300SB-C8 (4,6 мм × 150 мм). Пептиды разделяли после 5 минутного выдерживания в начальных условиях с линейным градиентом от 0% до 17% растворителя В за 57 минут, до 32% растворителя В в 149 минут, до 45% растворителя В в 162 минуты и до 95% растворителя В в 173 минуты. В 179 минут колонку регенерировали при 100% растворителя А в течение 25 минут, в течение всего времени хроматографирования 204 минуты. Растворитель А состоял из 0,1% TFA в воде, а растворитель В состоял из 0,08% TFA в ацетонитриле. Колонку поддерживали при 37°С и элюировали со скоростью потока 0,5 мл/мин. Профиль элюции подвергали мониторингу при 214 нм и 280 нм. Массу трипсиновых пептидов определяли с помощью жидкостной хроматографии - масс спектрометрического (LC-MS) анализа отделенной расщепленной смеси, используя масс-спектрометр LTQ ORBITRAP™.

Содержание свободных сульфгидрильных групп по анализу Эллмана: в образцах пертузумаба меняли буфер на рабочий буферный раствор (100 мМ фосфата калия, 1 мМ EDTA, 8 M мочевины, рН 8) и доводили до концентрации, которая в результате давала концентрации свободного тиола в пределах диапазона стандартной кривой. Готовили раствор дитионитробензола (DTNB) (10 мМ) и стандартные растворы цистеина (восемь точек между 0 и 100 мкМ) в рабочем буферном растворе. В 96-луночный планшет добавляли 165 мкл образца или стандарта для лунок в трех повторах. Реакцию инициировали добавлением 10 мкл DTNB, а затем инкубировали в течение 30 минут. После инкубирования измеряли поглощение при 412 нм, используя планшетный ридер SPECTRAMAX М²®. Концентрацию свободных тислов вычисляли, используя линейное уравнение, полученное из стандартной кривой. Концентрацию белка определяли, используя поглощение при 280 нм, полученное на спектрофотометре. Свободный тиол отражали в виде молей свободного тиола на моль пертузумаба.

Папаиновая HIC: для получения образцов пертузумаба, расщепленных папаином, образцы расщепляли папаином после удаления С-концевого лизина карбоксипептидазой В (СрВ). Домены Fab и Fc разделяли с помощью HIC, используя полипропиласпартамидную колонку (4,6 мм × 100 мм, 1500 Å, 3 мкм). Растворитель А состоял из 1,6 M сульфата аммония, 20 мМ фосфата калия, рН 6,05, а растворитель В состоял из 20 мМ фосфата калия рН 6,05. Аналиты разделяли градиентом от 0% до 18%) растворителя В от 3 до 6 минут, до 24%) растворителя В на 21 минуте. Колонку поддерживали при 25°С со скоростью потока 0,8 мл/мин. Профиль элюции подвергали мониторингу при 280 нм.

HIC интактного антитела: образцы интактного пертузумаба разделяли с помощью HIC, используя полипропиласпартамидную колонку (9,4 мм × 100 мм, 1500 Å, 3 мкм). Растворитель А состоял из 1,0 M сульфата аммония, 20 мМ фосфата калия, рН 6,05, а растворитель В состоял из 20 мМ фосфата калия, рН 6,05. Аналиты разделяли изократически, используя 12% растворитель В в течение 25 минут. Колонку поддерживали при 30°С со скоростью потока 2 мл/мин. Профиль элюции подвергали мониторингу при 280 нм.

SDS-PAGE с идентификацией белков по «отпечаткам пептидных масс»: образцы пертузумаба, как восстановленного, так и невосстановленного, анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). Образцы (5 мкг) денатурировали нагреванием в присутствии SDS-PAGE буфера для образца в течение 5-10 минут при 60±2°С с йодацетамидом для невосстановленных образцов. Образцы восстанавливали в течение 15-20 минут при 60°С±2°С в присутствии 80 мМ дитиотреитола (DTT). Денатурированные образцы разделяли в 4%-20% полиакриламидных градиентных гелях и окрашивали красителем SYPRO™ Ruby для получения профиля исчерченности белка. Наряду с образцами пертузумаба, в гели были включены стандарты молекулярных масс и стандарты чувствительности окрашивания SYPRO™ Ruby (2 нг/дорожка и 8 нг/дорожка сывороточного альбумина (BSA)).

Отпечатки пептидных масс представляет собой аналитическую методику для идентификации белка. Гели загружали 10 мкг коммерчески доступной партией стандартного образца анти2С4907-2 и Серией 5. Все полосы, разделенные с помощью SDS-PAGE, были расщеплены на пептиды под действием трипсина. Абсолютные массы пептидов точно измеряют с помощью BRUKER™ времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF MS). Перечни пептидных масс были использованы для идентификации белков путем исследования последовательностей белков. Все наблюдаемые полосы как невосстановленного, так и восстановленного пертузумаба, были идентифицированы по отпечаткам пептидных масс.

Эффективность по данным биоанализа: способ оценки эффективности пертузумаба оценивает эффективность пертузумаба путем определения его способности ингибировать пролиферацию клеточной линии рака молочной железы человека, экспрессирующей HER2. В характерном исследовании 96-лучночный планшет(ы) засевали клетками злокачественной опухоли молочной железы и инкубировали во влажной камере. После инкубирования среду удаляли и добавляли различные концентрации стандартного образца пертузумаба, аналитического контроля и образец (образцы). Затем планшет(ы) инкубировали к относительное число жизнеспособных клеток опосредовано количественно анализировали, используя окислительно-восстановительный краситель ALAMARBLUE®. Флуоресценцию измеряли, используя возбуждение при 530 нм и эмиссию при 590 нм. ALAMARBLUE® имеет синий цвет и не является флуоресцирующим в окисленном состоянии, но восстанавливается под действием внутриклеточной среды клетки до розовой формы, которая является сильно флуоресцирующей (Page et al. Int. J. Oncol. 3: 473-476 (1993)). Изменения цвета и флуоресценции пропорциональны числу жизнеспособных клеток. Результаты, выраженные в относительных единицах флуоресценции (RFU), наносили на график в зависимости от концентраций пертузумаба и программа параллельных линий была использована для оценки антипролиферативной активности образцов пертузумаба относительно стандартного образца.

Результаты

Распределение дисульфидных связей: в пертузумабе находятся 32 цистеина, образующие 16 дисульфидных связей, из которых четыре являются межцепочечными, а 12 являются внутрицепочечными связями. Однако, вследствие мультимерной природы молекулы, существует только девять различимых дисульфидных связей. Нативный белок расщепляли трипсином для достижения высвобождения всех дисульфид-связанных пептидов. Хроматографические профили для партий пертузумаба показаны на Фиг. 7. LC-MS анализ с обращенной фазой расщепленной коммерчески доступной партии стандартного образца анти2С4907-2 предоставлял все ожидаемые дисульфид-связанные пептидные пары (таблица 2).

Идентифицированные пептиды дополнительно подтверждали путем идентификации ожидаемых пептидов из пептидных пар при восстановлении дисульфидов (Фиг. 8 с развернутыми видами на фиг. 9 и 10). Димер пептида тяжелой цепи Т19Н (Т19Н=Т19Н) был идентифицирован как содержащий две дисульфидные связи; предполагалась идентификация Cys228=Cys228 и Cys231=Cys231 пар. Одна дисульфидная пара T18H=T20L, была обнаружена с помощью LC-MS, но элюировала близко к исключенному объему и была неидентифицируемой в виде различимого пика на ультрафиолетовых (UV) хроматограммах. Присутствие этой дисульфидной пары дополнительно подтверждалось LC-MS анализом расщепления Lys-C, где наблюдался пептид T18H=T19L-T20L. Неожидаемых связей обнаружено не было. Одна дисульфидная связь является частично непарной, как рассмотрено ниже.

Анализ свободных сульфгидрильных групп: все остатки цистеина в пертузумабе с правильной укладкой молекулы должны быть вовлечены в дисульфидные связи. Анализ по Эллману (Ellman, G. Arch. Biochem. Biophys. 82: 70-77 (1959)), способ определения содержания свободных сульфгидрильных групп пептидов и белков, использовали для определения присутствия в пертузумабе реакционноспособных немодифицированных (свободных) тиолов. Все вещества оценивали на содержание свободных тиолов (неспаренных остатков цистеина), и результаты суммированы в таблице 3.

Приблизительно 0,1-0,3 моля свободных тиолов на моль пертузумаба наблюдалось во всех анализируемых партиях. В отсутствие 8 М мочевины уровни свободных тиолов были ниже предела количественного обнаружения (QL; приблизительно 0,1 моль свободного тиола на молекулу белка) во всех тестируемых веществах, указывая на то, что свободные тиолы (то есть, неспаренные цистеины), присутствующие в молекуле пертузумаба, были скрыты и недоступны для реактива Эллмана в неденатурирующих условиях.

Анализ веществ пертузумаба с помощью HIC после СрВ и папаинового расщепления, обнаружил дополнительный пик между пиками Fc и Fab, который был идентифицирован как вариант Fab, содержащий неспаренные остатки цистеина в положениях Cys23 и Cys88 (фиг. 11 и 12, отмеченные как Fab со свободными тиолами). Эта идентификация была подтверждена LC-MS картированием триптического пептида, где образец подвергали денатурации в присутствии NEM до восстановления и расщепления трипсином. Была измерена степень свободного тиола варианта Fab с использованием способа папаиновой HIC всех партий пертузумаба и было обнаружено, что она соответствует таковой с использованием текущего способа (таблица 4).

По данным HIC анализа с папаином значения для веществ, полученных с использованием промышленного способа, находятся в интервале от 12,7% до 13,5%, тогда как величина для партии стандартного образца 2С4-900-1 (Phase 1/II) была несколько ниже на уровне 9,4%.

Преобразование % Fab варианта по результатам HIC с папаином в расчетный % варианта интактного антитела: относительное количество Fab фрагментов, содержащих неспаренные цистеины, может быть использовано для вычисления относительного распределения гетеродимерных или гомодимерных форм вариантов с неспаренными цистеинами. В тех случаях, когда HIC анализ с папаином показывает, что 10% (или х%) Fab фрагментов пертузумаба содержат неспаренные цистеины в положениях Cys23/Cys88, то должно быть 10 Fab фрагментов, содержащих неспаренные цистеины, высвобожденных из каждых 50 молекул пертузумаба, поскольку расщепление 50 антител папаином должно давать 100 фрагментов Fab. Принимая во внимание тот факт, что эти 10 фрагментов Fab получены из 10 разных молекул пертузумаба, относительное количество пертузумаба, содержащего один Fab Cys23/Cys88 неспаренными цистеинами составляет приблизительно 20%, то есть 10 из 50 молекул пертузумаба, (или 2х%). Более точно, если возможность того, что пертузумаб с двумя Fab, содержащими Cys23/Cys88 неспаренные цистеины, принять во внимание, то относительно количество гетеродимерные варианты пертузумаба с неспаренными цистеинами должны составлять 2×10%×90%=18% (или 2×х%×[100-х]%). Кроме того, относительное количество гомодимерных вариантов пертузумаба с неспаренными цистеинами должно составлять 10%×10%=1% (или х%×х%). В этом случае, относительное число пертузумаба, содержащего 2 Fab без неспаренных цистеинов на любом из Fab, должно составлять 90%×90%=81% (или [100-х]%×[100-х]%).

Кроме того, гомодимер дикого типа (без неспаренных цистеинов) и гетеродимер (с неспаренными цистеинами на одном Fab) могут быть количественно проанализированы непосредственно с помощью HIC. HIC интактного антитела разделяет пертузумаб на два основных пика (Фиг. 13), которые были идентифицированы как гомодимер дикого типа (без свободных тиолов) и гетеродимер (со свободной тиольной парой на одном Fab) с помощью LC-MS картирования триптического пептида. Плечо минорного фронтального пика также собирали и характеризовали с помощью HIC с папаином, преимущественно в виде гомодимера (свободная тиольная пара на обоих Fab, приблизительно 40%) и пертузумаб с окислением Fe. Используя HIC интактного антитела, было определено, что пертузумаб содержит приблизительно 17%-18% гетеродимера для веществ, полученных с использованием текущего процесса, и 13% с использованием процесса Фаза I/II (таблица 5). Не связываясь какой-нибудь одной теорией, возможно, что повышенное количество варианта с неспаренными цистеинами, полученного промышленным способом (по сравнению с процессом фазы I/II) может являться результатом скорости укладки белка (то есть VL домена) нарастающей быстрее, чем скорость окисления тиола (образование дисульфида), таким образом, удерживая свободные цистеины в этом варианте.

Поскольку пары неспаренных цистеинов в положениях Cys23/Cys88 на легкой цепи пертузумаба наблюдали с помощью HIC, очищенные фракции каждого варианта с неспаренными цистеинами были протестированы в антипролиферативном исследовании. Fab, содержащие неспаренные цистеины, очищали и анализировали на наличие сниженной эффективности (оцениваемая эффективность ~50% по сравнению с нативным Fab) (таблица 6).

Кроме того, три интактные формы (гомодимер дикого типа, гетеродимер, содержащий свободные тиолы и гомодимер, содержащий неспаренные цистеины) были выделены с помощью HIC и протестированы в анализе антипролиферативной эффективности. Смотри таблицу 7.

Эти данные демонстрируют, что вариант пертузумаба с неспаренными цистеинамк присутствует в композиции, полученной в коммерческом масштабе. Способы HIC (определяющие Fab фрагмент или интактное антитело) в этом примере или пептидное картирование в примере 3, приведенном ниже, представляют собой исследования, которые могут быть использованы для оценки присутствия и количественного определения варианта с неспаренными цистеинами в композиции пертузумаба.

Пример 2

Композиция пертузумаба, лишенного фукозы, и ее характеристика

Антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) является аспектом клеточного иммунитета, посредством которого эффекторная клетка активно лизирует клетку-мишень, которая связалась с антиген-специфичными антителами. Пертузумаб демонстрировал ADCC активность при тестировании с клетками HER2 3+, но очень небольшая активность наблюдалась с клетками HER2 1+ (Фиг. 14).

Уровни дефукозилирования в стандартных образцах пертузумаба Фазы I и Фазы III измеряли, используя капиллярный электрофорез. Более высокий уровень дефукозилированного вещества (G0-F=2,2%) в стандартном образце пертузумаба Фазы III коррелирует с более высокой ADCC активностью, наблюдаемой по сравнению со стандартным образцом Фазы I (Фиг. 15), который имел более низкий G0-F (0,8%). Также был получен и протестирован ферментативно дегликозилированный пертузумаб, и было показано отсутствие связывания с FcγRIIIa и отсутствие ADCC активности (таблица 8).

Эти данные показывают, что измерение G0-F (дефукозилированного) пертузумаба является эффективным средством для количественной оценки ADCC активности пертузумаба. Эксперименты для количественного анализа дефукозилирования представляют собой следующее.

Анализ олигосахаридов с использованием капиллярного электрофореза (СЕ): образцы пертузумаба (250-500 мкг) очищали, используя аффинные наконечники для твердофазной экстракции с Белком A (PHYTIPS™) и автоматизированную рабочую станцию дозирования жидкостей. Образцы пертузумаба элюировали со смолы на основе белка А, используя 12 мМ соляную кислоту, рН 2,0 и нейтрализовали, используя 10 мкл 50 мМ сукцината натрия. Полученный в результате образец инкубировали с 2,5 Ед/мл oPNGaзы F в течение 15 часов при 37°С. Белок осаждали нагреванием раствора при 95°С в течение 5 минут и удаляли центрифугированием. Растворы супернатанта, содержащие высвобожденные олигосахариды, сушили под вакуумом. Получали производные высвобожденных гликанов с использованием 8-аминопирен-1,2,6-трисульфоновой кислоты (APTS) в 15% растворе уксусной кислоты, содержащем цианоборгидрид натрия при 55°С в течение двух часов. Анализы производных гликанов проводили с помощью системы капиллярного электрофореза (СЕ), снабженной модулем для флуоресцентной детекции, используя аргон-ионный лазер (488 нм возбуждение, 520 нм эмиссия) и капилляры, покрытые N-CHO (50 мк × 50 см). Подвижный буфер представлял собой 40 мМ ε-амино-н-капроновую кислоту/уксусную кислоту, рН 4,5, 0,2% гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС). Образцы вводили в капилляр под давлением 0,5 фунтов на квадратный дюйм. Разделение проводили при 20 кВ, и температуру капилляра поддерживали при 20°С.

Пертузумаб содержит N-связанный олигосахаридный сайт в C_H2 домене Fc части молекулы в положении Asn299. Относительное распределение нейтральных олигосахаридов, обнаруженное в этом сайте для каждой партии определяли, используя СЕ после обработки PNGaзой F и мечения APTS.

Электрофореграммы, полученные в результате СЕ анализа высвобожденных производных олигосахаридов показаны на Фиг. 16 с профилями в развернутом виде на Фиг. 17. Относительные количества олигосахаридов в пертузумабе для анализируемых веществ изложены в таблице 9.

Олигосахарид со структурой GO является преобладающим видом во всех веществах (62%-75%). Гликоформа G0 была несколько более распространенной в Сериях 3-7 и предыдущей партии стандартного образца 2С4-900-1 (70%-75%) по сравнению с текущей партией стандартного образца анти2С4907-2 и Серией 1 (62%-64%). Гликоформа G1 наблюдалась в виде двух пиков, соответствующих двум изомерам с концевой галактозой любой из ветвей двух-антенарной структуры. Площади этих двух пиков объединяли для определения относительного количества гликоформы G1. Гликоформы G1 и G2 насчитывают приблизительно 18%-29% и 1%-3%, соответственно высвобожденных олигосахаридов для всех веществ. Пики, возникающие вследствие других олигосахаридных структур, также наблюдались на электрофореграммах (все присутствуют на уровне 3% или менее). Эти структуры включают G0-F (G0, лишенный коровой фукозы), G0-GlcNAc (G0, лишенный одного GlcNAc), Man5, и другие второстепенные гликоформы (Ma and Nashabeh Anal Chem 71:5185-92 (1999)). Олигосахаридные структуры на пертузумабе согласуются со структурами, обнаруженными в СНО-полученных MAb (Ma and Nashabeh, supra) и природных иммуноглобулинах человека (Flynn et al. Mol Immunol 47:2074-82 (2010)).

Пример 3

Пептидное картирование и RP-HPLC для характеристики варианта с неспаренными цистеинами

Материалы: Материалы и устройства, используемые в этих экспериментах, включают: 3-[N-морфолино]пропансульфоновую кислоту (MOPS; Sigma-Aldrich), N-этилмалеимид (d0-NEM; Thermo Scientific, Rockford, II), N-этилмалеимид (d5-NEM; Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA), L-цистеин (Sigma-Aldrich), трипсин (Promega, Madison, WI), трифторуксусную кислоту (TFA; Fisher, Fair Lawn, NJ), ацетонитрил (ACN, Burdick & Jackson, Muskegon, MI). Все химические вещества и реактивы были использованы в том виде, в котором получены, без дополнительной очистки.

Дифференциальное мечение антител N-этилмалеим идом (NEM): способ дифференциального NEM мечения дает возможность метить свободные тиолы, уже присутствующие в антителах, с использованием d0-NEM, и сохранять дисульфидные мостики восстановленными и мечеными d5-NEM. Для начального мечения d0-NEM, 100 мкл антитела (3 мг/мл) осторожно перемешивали с 400 мкл денатурирующего буфера (7,5 M GdnHCl, рН 5) содержащего 6,25 мМ d0-NEM, и инкубировали 37°С в течение 2 ч. К образцу добавляли 20 мкл цистеина (125 мМ) и инкубировали 37°С в течение 15 минут для инактивации оставшегося d0-NEM. Для восстановления оставшихся дисульфидных мостиков в антителе к образцу добавляли 10 мкл ТСЕР (0,5 М) и инкубировали 37°С в течение 30 минут. Затем к образцу добавляли 70 мкл d5-NEM (171 мМ) и инкубировали 37°С в течение 2 ч, чтобы пометить свободные тиолы, образовавшиеся путем восстановления дисульфидных мостиков. В 0,5 мл образца, дифференциально меченого NEM, меняли буфер, используя колонки NAP-5, и элюировали 0,6 мл буфера MOPS (20 мМ MOPS, 0,5 мМ ТСЕР, рН 7).

Пептидное картирование антител: образцы, дифференциально меченые NEM, расщепляли трипсином в соотношении 1:50 (об/об) трипсин: антитело при 37°С в течение 2 ч. Реакции расщепления гасили 10% TFA. Расщепленные трипсином, дифференциально меченые NEM образцы разделяли, используя систему Agilent 1200 HPLC (Agilent, Palo Alto, С А)..Для хроматографического разделения образцов использовали колонку Jupiter C18 (250×2 мм, 5 мкм) (Phenomenex, Torrance, СА) с размером пор 300 Å. Объем введенной пробы составлял 95 мкл, а температура колонки составляла 55°С. Подвижная фаза А представляла собой 0,1% TFA в воде, а подвижная фаза В представляла собой 0,08% TFA в 90% ACN (об/об). Начальные условия были установлены при 100% подвижной фазы А и поддерживались в течение первых 3 минут после введения образца. Подвижная фаза В повышалась до 10% на протяжении следующих 20 минут, а затем дополнительно повышалась до 40% до 160 минуты и 100% до 162 минуты, везде линейные градиенты. Подвижную фазу В удерживали при 100% до 170 минуты. Колонку снова уравновешивали при 100% подвижной фазы А до 195 минуты. Скорость потока поддерживали при 0,28 мл/мин.

Компонент, элюируемый в результате HPLC, напрямую соединяли с источником ионизации электрораспылением LTQ ORBITRAP™ масс спектрометром, работающим в режиме определения положительных ионов. Напряжение при распылении составляло 4,5 кВ, а температура капилляра составляла 300°С. Масс-спектрометр работал в информационно-зависимом режиме для автоматического переключения между режимами MS и MS/MS. Определение полного сканирования MS спектров получали от m/z 300 до m/z 2000 в FT-Orbitrap с установкой разрешения R=60000 при m/z 400. Пять наиболее интенсивных ионов были фрагментированы в линейной ионной ловушке, используя индуцированную столкновением диссоциацию (CID) при стандартной энергии столкновений 35% со временем активации 30 мсек, и шириной изоляции 2,5 m/z единиц. Функция динамического исключения (DE) была задействована для уменьшения избыточности данных и возможности отбора ионов низкой интенсивности для информационно-зависимых MS/MS сканов. Параметры динамического исключения были следующими: длительность повторов 30 секунд, размер списка исключения 500, длительность исключения 90 секунд, нижняя ширина эксклюзионной массы 0,76,верхняя ширина эксклюзионной массы 1,56, и число повторов 2. Анализ данных проводили, используя программное обеспечение XCALIBUR™.

Текущую партию стандартного образца пертузумаба анти2С4907-2 анализировали, используя способ, описанный вше. Было обнаружено, что 10,9% T2L пептидов (полученных расщеплением трипсином и содержащие Cys23) и 8,3% T7L пептидов (полученных расщеплением трипсином и содержащие Cys88), были мечены d0-NEM. Поскольку только неспаренные цистеины были мечены d0-NEM в этом эксперименте, эти результаты дают возможность предположить, что приблизительно 10% Cys23 и Cys88 в анти2С49.07-2 не связаны дисульфидной связью (то есть 10% вариантов с неспаренными цистеинами). Используя способ расчета, аналогичный описанному выше, для преобразования процента неспаренных цистеинов Fab варианта в процент неспаренных цистеинов интактного варианта, было определено, что 18% молекул пертузумаба в анти2С4907-2 представляют собой гетеродимерные варианты с неспаренными цистеинами, 1% молекул пертузумаба представляют собой гомодимерные варианты с неспаренными цистеинами, и 81%) представляют собой гомодимерную форму дикого типа (без неспаренных цистеинов). Эти результаты согласуются с результатами анализа HIC либо Fab фрагментов, либо интактного пертузумаба.

Ограниченное расщепление эндопротеазой Lys-C для получения Fab: Fab фрагмент MAb А получали путем ограниченного расщепления Lys-C. Вкратце, MAb А (1 мг/мл) перемешивали с ферментом Lys-C в соотношении 1:400 в 100 мМ Трис, рН 7,6, а затем смесь инкубировали при 37°С в течение 30 минут. Реакционную смесь метили NEMin рН 5,5, 350 мМ ацетата натрия и 8 M гуанидин HCl. Продукты расщепления анализировали способом RP-HPLC, описанным ниже.

Условия проведения RP-HPLC: RP-HPLC анализ проводили на системе AGILENT 1200™ HPLC (Palo Alto, СА, USA), снабженной двухкомпонентным градиентным насосом, автодозатором, колоночным отделением с температурным контролем, и детектором на диодной матрице. Система включала колонку для хроматографии с обращенной фазой Pursuit 3 Dyphenyl (150×4,6 мм, 3 мкм, Varian, Lake Forest, CA, USA), которая хроматографировала при 75°С и со скоростью 1 мл/мин. Разделение подвергали мониторингу, используя поглощение при 280 нм. Подвижная фаза состояла из 0,1% TFA в воде (подвижная фаза А) и 0,09% TFA в ACN (подвижная фаза В). 38-минутный способ начинался с трех минутного градиента от 32% до 36% подвижной фазы В, с последующим 18 минутным линейным градиентом до 42% подвижной фазы В. Колонку промывали при 95% подвижной фазы В в течение 5 минут и уравновешивали при 32% подвижной фазы В в течение 10 минут.

RP-HPLC анализ свободных тиолов Fab, образованных ограниченным расщеплением Lys-C (Фиг. 18) показал, что Fab со свободными тиолами составляет около 13%, что соответствует HIC в примере 1. Fab со свободными тиолами, меченый NEM, становится более гидрофобным, следовательно, элюирует позже по сравнению с Fab со свободными тиолами (Фиг. 18) и дополнительно подтверждение присутствие свободного тиола. Смотри также Фиг. 19, на которой пептидное картирование подтверждает наличие Fab со свободными тиолами.

Пример 4

Количественная оценка дефукозилирования с помощью CE-LIF

В этом примере описывается полностью утвержденный капиллярный электрофоретический анализ с лазерно-индуцированной флуоресценцией (CE-LIF) для количественной оценки варианта пертузумаба, лишенного фукозы. Модификации способов, описанных в примере 2, приведенном выше, включают: отсутствие автоматизированной подготовки образца, отсутствие стадии очистки с Белком А, обеспечивающее постоянные концентрации белка среди образцов, и изменение электрофоретических параметров (концентрация буферных эксципиентов).

В этом исследовании образцы пертузумаба разбавляют до 10 мг/мл, используя рецептурный буфер, и буфер меняют на расщепляющий буфер Пептид-N-Гликаназа F (PNGaзa F). Олигосахариды, связанные с аспарагином, затем ферментативно высвобождают, используя PNGазу F. Затем, получают производные высвобожденных гликанов под действием 8-аминопирен-1,3,6-трисульфоновой кислоты (APTS), отрицательно заряженного флуорофора. APTS обеспечивает всем гликанам три отрицательных заряда, что дает возможность провести быстрый электрофоретический анализ. Смесь, содержащая избыток вещества, используемого для получения производных, и конъюгаты APTS-гликан, анализируют посредством СЕ, используя покрытый капилляр, который уменьшает электроосмотический поток. Разделение контролируют с помощью системы индуцированной лазером флуоресценции, используя аргоновый ионный лазер с длиной волны возбуждающего света 488 нм и полосовым фильтром спектра излучения 520 нм.

Используя этот анализ, корреляционный график показан на Фиг. 21. Используя корреляционный график (%ADCC=30,133+12,439х, где x=%G0-F) и диапазон ADCC 40 135%, окончательный вариант описания для пертузумаба соответствует 0,9-4,1% G0-F.

Таким образом, используя этот утвержденный CE-LIF анализ, возможно охарактеризовать композиции пертузумаба для подтверждения, что биологическая активность в значениях ADCC находится в желаемом диапазоне (40-135%) ADCC активности =0,9-4,1% G0-F).

Пример 5

Разновидности пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS), низкой молекулярной массой (LMWS) и их характеристика

Пертузумаб анализировали с помощью SE-HPLC и CE-SDS для определения количества разновидностей с высокой молекулярной массой (HMWS), в основном, димера, и разновидностей с низкой молекулярной массой (LMWS). Отсутствовало различие в HMWS при разбавлении, что дает основание предполагать, что агрегаты являются недиссоциирующими. Было хорошее совпадение между результатами аналитического ультрацентрифугирования (AUC) и SE-HPLC в значениях количественной оценки HMWS, показывающее отсутствие доказательств, что эксклюзионная хроматография пропустила или занизила значительные HMWS.

Материалы и методы

Тестируемые композиции пертузумаба: в этом примере описывается характеристика текущей партии стандартного образца пертузумаба анти2С4907-2 и Серии 1, представляющей клинический материал Фазы III, и пять коммерческих партий Фазы III/ (Серии 3-7), все получены в масштабе 12000 liter (L), используя промышленный способ.

Выделенные HMWS: для получения репрезентативных HMWS используемых для биологической характеристики, партию пертузумаба из Серии 3 вводили в систему препаративной HPLC, используя препаративную колонку для SE-HPLC (TSK G3000SW, 21,5 мм × 600 мм) и ту же изократическую подвижную фазу, как описано выше, при скорости 4,5 мл/мин. Разновидности с высокой молекулярной массой фракционно собирали и затем проводили замену буфера на рецептурный буфер. Было показано, что чистота HMWS составляет 70% по данным последующего SE-HPLC анализа с оставшимся преобладающим основным пиком. Основной пик также собирали, и было показано, что чистота составляет 100%.

Выделенные LMWS: для получения выделенных LMWS, номер партии из Серии 3 расщепляли папаином и подвергали расщеплению папаином и подвергали сбору фракций, используя препаративную HPLC, как указано выше. Верифицированные преобладающие формы представляли собой Fc и Fab по данным интактного анализа ESI-MS. Было показано, что чистота LMWS составляет be 99% по данным последующей аналитической SE-HPLC. Выделенные варианты Fab также получали, используя обработку папаином, и собирали с помощью препаративной IE-HPLC. Было показано, что чистота варианта Fab составляет 100% по данным последующей аналитической SE-HPLC.

SE-HPLC: Аликвоты пертузумаба разбавляли до 10 мг/мл подвижной фазой (0,2 M фосфата калия, рН 6,2, 0,25 M хлорида калия). Образцы разделяли на колонке TSK G3000SW_XL, (7,8 мм × 300 мм), которую элюировали изократически. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин, а температура колонки была при окружающей температуре. Профиль элюции подвергали мониторингу при 280 нм. Для детекции с помощью многоуглового рассеяния света (MALS), образцы пертузумаба разделяли, используя две колонки последовательно соединенные линейно с детектором WYATT DAWN HELEO™ MALS (использующим 658 нм лазер, 17 детекторов) и WYATT OPTILAB™ rex рефрактометрический детектор.

CE-SDS: получали производное каждой партии пертузумаба с использованием 5-карбоксимтетраметилродаминсукцинимидилового сложного эфира, флуоресцентного красителя. После удаления свободного красителя с использованием колонок NAP-5. невосстановленные образцы были получены добавлением 40 мМ йодацетамида и нагреванием при 70°С в течение 5 минут. Для анализа восстановленных образцов производное пертузумаба перемешивали с додецилсульфатом натрия (SDS) и 1 M DTT до конечной концентрации 1% SDS (об/об). Затем образцы нагревали при 70°С в течение 20 минут. Полученные образцы анализировали на системе СЕ, используя капилляр из плавленного кварца 50 мкм внутренний диаметр × 31,2 см, поддерживаемый при 20°С на протяжении всего анализа. Образцы вводили в капилляр путем электрокинетического ввода при 10 кВ в течение 40 секунд. Разделение проводили при постоянном напряжении 15 кВ в режиме обратной полярности (отрицательная к положительной), используя CE-SDS подвижный буфер в качестве фильтрационной среды. Аргоновый ионный лазер, работающий при 488 нм, использовали для возбуждения флуоресценции с получением результирующего сигнала эмиссии, контролируемого при 560 нм.

Результаты и обсуждение

SE-HPLC представляет количественную информацию примерного распределения по размеру молекул нативного белка. Профили SE-HPLC для партий пертузумаба показаны на Фиг. 25, а развернутый вид профилей показан на Фиг. 26. Относительное распределение, по площади пика эксклюзионных пиков приведено в таблице 10.

Доля пертузумаба, элюирующего в основном пике, составляла более 99% для всех веществ. Количество разновидностей в высокой молекулярной массой (HMWS) находилось в интервале от 0,1% до 0,2%, а количество разновидностей с низкой молекулярной массой (LMWS) составляло ≤0,1%. Все партии показали сходные хроматографические профили. Было показано, что очищенная фракция HMWS, включающая димеры и агрегаты более высокой степени, имеет 46% специфическую активность по сравнению с партией стандартного образца анти2С4907-2.

SE-HPLC проводили как с чистыми, так и с разбавленными образцами, выдерживаемыми при 30°С для изучения HMWS пертузумаба как в отношении быстро, так и в отношении медленно диссоциирующих агрегатов, которые могли быть результатом разбавления и/или длительного воздействия повышенной комнатной температуры. Отсутствовало снижение содержания HMWS разбавленной и/или нагретой партии стандартного образца анти2С4907-2 по сравнению с контролем.

SE-HPLC разделение, объединенное с MALS, проведенное с партией стандартного образца анти2С4907-2, подтвердило, что основной пик SE-HPLC представляет собой мономер, с молекулярной массой приблизительно 150 кДа.

AUC в режиме скорости седиментации использовали для характеристики HMWS, находящихся в образцах пертузумаба. Скорость седиментации представляет собой методику, не зависимую от эксклюзионной хроматографии, которая измеряет уровни HMWS в образце в отсутствии твердой матрицы колонки. AUC проводили на образцах пертузумаба с повышающимися уровнями HMWS для определения способности SE-HPLC одинаково обнаруживать все основные HMWS пертузумаба, путем сравнения уровней и видов агрегатов, определенных скоростью седиментации, для обнаруженных с помощью SE-HPLC. Пять образцов в интервале от 0,2% до 7,2% всех HMWS (обнаруженных с помощью SE-HPLC) были охарактеризованы скоростью седиментации и обозначены A-Ε в таблице 11 и на Фиг. 27.

Эти образцы состояли из репрезентативной партии лекарственного препарата пертузумаб (отмечено А) и четырех образцов, обогащенных HMWS. Образцы, обогащенные HMWS, были выбраны как репрезентативные для широкого ряда механизмов разрушения (воздействие света, воздействие кислого рН и очищенные IE-HPLC основные варианты),.

SE-HPLC показала один основной пик HMWS для образцов А, В, С и Ε и два пика HMWS для образца D (Фиг. 27). Для образцов А, В, С и Е, AUC показало только один пик HMWS с коэффициентом седиментации примерно 9,1S. В образце D, AUC показало два пика HMWS с коэффициентами седиментации примерно 9,1S и 10,8S. HMWS, обнаруженные с помощью AUC совпадали с результатами SE-HPLC; оба способа показали одни основной продукт разрушения, с минимальными уровнями более крупных HMWS в образце D.

Сравнение количественных результатов этих образцов по данным двух способов представлено в таблице 11.

Для образцов С, D и Е существует хорошее соответствие в проценте HMWS, определенном с помощью обеих методик. Низкий уровень HMWS, находящихся в образцах А и В, препятствует точному количественному определению разновидностей с помощью AUC, которое имеет предел оценки количественного определения 3,7% (Gabrielson and Arthur, Methods 54:83-91 (2011)). Это отражается очевидным расхождением в проценте HMWS между SE-HPLC и AUC (таблица 11). Оценивали корреляцию по всему диапазону уровней HMWS Вычисленный коэффициент корреляции (Lin, L, Biometrics 45:255-68 (1989)) составил 0,97 (n=5), указывая на хорошее соответствие между AUC и SE-HPLC для количественного определения HMWS (Фиг. 28).

Эти результаты подтверждают, что SE-HPLC является надежным способом измерения HMWS для пертузумаба. SE-HPLC обладает способностью обнаруживать и точно количественно определять все разновидности HMWS, наблюдаемые с помощью AUC.

Гетерогенность, основанная на размере, проанализированная с помощью SE-HPLC, SDS-PAGE и CE-SDS, была сопоставимой среди всех партий. SE-HPLC анализ показал, что сходные уровни HMWS (0,1%-0,2%) и LMWS (0,0%-0,1%) для всех протестированных партий. Профили полос, выявленных с помощью SDS-PAGE анализа для восстановленных и невосстановленных образцов совпадали с электрофоретическими профилями, полученными с помощью CE-SDS.

В одном варианте осуществления количества основных видов пертузумаба и варианта HMWS и варианта LMWS, определенных с помощью SE-HPLC представляли собой следующее:

≥96% Основной пик например ≥96,7% Основной пик, например ≥97,3% Основной пик например ≥97,4% Основной пик ≤2% HMWS, например ≤1,7% HMWS, например ≤1,5% HMWS, например ≤1,4% HMWS, например ≤0,8% HMWS.

≤2% LMWS, например ≤1,6% LMWS, например ≤1,2% LMWS, например ≤0,6% LMWS.

Обе фракции пертузумаба HMWS и LMWS, очищенные с помощью SE-HPLC, демонстрировали сниженную антипролиферативную активность по сравнению с основным пиком и контролем, который был полностью активным. Варианты всех размеров показали сопоставимую активность связывания HER2 и активность связывания FcRn по сравнению с контролем, за исключением LMWS, которые показали более низкое связывание с FcRn. Поскольку образец LMWS содержит 2/3 Fab фрагментов и 1/3 Fc фрагментов, ожидается более низкая антипролиферативная и FcRn связывающая активность. HMWS показали более высокую активность связывания с FcγRIIIa (CD16) VI58, но более низкую ADCC активность. LMWS показали более низкую активность связывания FcγRIIIa (CD 16) V158, a ADCC активность не наблюдалась для этого варианта (таблица 12).

Капиллярный электрофорез с додецилсульфатом натрия (CE-SDS): детекторный анализ CE-SDS с индуцированной лазером флуоресценцией (LIF) представляет собой высокочувствительный анализ, который обеспечивает средство количественной оценки распределения белков по размеру молекул в денатурирующих условиях. При CE-SDS анализе невосстановленных образцов (Фиг. 29), пертузумаб перемещался в виде высокого пика, составляющего 96%-98% всей площади пика с меньшими пиками, представляющими LMWS и HMWS. Количество HMWS, определенное с помощью этой методики, составило 0,6% для всех протестированных веществ. Оставшиеся виды перемещаются в виде LMWS, как показано на Фиг. 30 (развернутый вид). Фрагментация образца, индуцированная нагреванием, минимизируется алкилированием (Salas-Solano et al. Anal Chem 78:6583-6594 (2006)). Относительное распределение видов, разделенных с помощью CE-SDS, представлено в таблице 13.

Наблюдалось незначительное отличие, где Пик 6 увеличивался от 0,9% в партии стандартного образца анти2С4-900-1 (процесс Фазы I/II) до 1,7%-2,3% для партии стандартного образца анти2С4907-2, Серия 1 и Серии 3-7.

В одном варианте осуществления основной пик пертузумаба (за исключением LMWS и HMWS), разделенный или выделенный с помощью NR-CE-SDS, составляет примерно от 95% примерно до 99%, например, примерно от 96,0% примерно до 97,8%. Необязательно, количество HMWS составляет ≤1%, например ≤0,6%, а количество LMWS составляет ≤4%, например ≤3,4% разделенных или выделенных с помощью CE-SDS.

Пример 6

Обнаружение и количественная оценка фрагментации пертузумаба

Целью этого примера была оценка способов эксклюзионной хроматографии (SE-HPLC), капиллярного электрофореза с додецилсульфатом натрия в редуцирующих условиях (R-CE-SDS), и CE-SDS в нередуцирующих условиях (NR-CE-SDS) для обнаружения фрагментов пертузумаба.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы, характеризуемые в этом исследовании, суммированы ниже. Они включают образцы пертузумаба, которые подвергались различным стрессовым условиям, которые в результате могли привести к повышенной фрагментации.

- Стандартный образец (2С4907-2)

- Подвергнутый термическому воздействию (42 дня, 40°С)

- Обработанный кислотой (рН 3,2, 1 день, 40°С)

- Ускоренная стабильность (30 дней при 40°С, затем хранение приблизительно при 5°С)

- Реальное время стабильности лекарственного препарата (DP) (Т=0 и Т=548 дней и хранение приблизительно при 5°С) и соответствующего лекарственного вещества (DS)

SE-HPLC проводили как описано в примере 5, приведенном выше, со следующими сообщаемыми величинами: LMWS, Основной пик, HMWS, и все другие значительные пики выше предела количественного определения (LOQ).

CE-SDS в редуцирующих условиях (R-CE-SDS) проводили в соответствии с примером 5, приведенном выше, с сообщаемыми величинами: Пик 1, LC, Пик 2, Пик 3, NGHC, НС, Пик 5, Неп. восст., и другие значительные пики выше LOQ.

CE-SDS в нередуцирующих условиях (NR-CE-CDS) проводили, как описано в примере 5, приведенном выше, с получением образцов, исключающим стадию восстановления антитела, для возможности проведения анализа в нередуцирующих условиях дитиотреитолом (DTT), отщепляемым в результате стадии комплексообразования SDS.

Качественные результаты, полученные с помощью SE-HPLC, NR-CE-SDS и R-CE-SDS, представлены на фиг. 31А-В, фиг. 32А-В и фиг. 33А-В, соответственно, а также в таблицах 14, 15 и 16, соответственно.

Идентификации пиков основаны на Hunt & Nashabeh Analytical Chemistry 71: 2390-2397 (1999) и Ma & Nashabeh Chromatographia Supplement 53: S75-S89 (2001). Для NR-CE-SDS анализа небольшой пик после Пика 2 обычно включен в виде части Пика 2 во время предоставления данных. Для этого исследования этот небольшой пик представлен отдельно в виде Пика 2а, чтобы отличить этот фрагмент от легкой цепи (LC).

Анализ данных: процент площади пика (или процент скорректированной площади пика, %СРА, или CE-SDS) релевантных фрагментов сравнивали для определения, обеспечивает ли какой-либо из CE-SDS способов неизбыточные данные по сравнению с SE-HPLC. Релевантные фрагменты включают пики с неизвестной структурой, или те, которые, как известно, содержат продукты, полученные в результате расщепления полипептидной цепи (цепей). Эти фрагменты отличаются от диссоциируемых фрагментов тяжелой и/или легкой цепи, не связанных дисульфидной связью, которые присутствуют в продуктах антител и обычно наблюдаются с помощью CE-SDS. Пики фрагментов должны быть отделены от других пиков для обеспечения чувствительного обнаружения и точного количественного определения.

Способность обнаруживать небольшие фрагменты: небольшие фрагменты могут наблюдаться как в R-CE-SDS, так и в NR-CE-SDS анализе, и они обозначены как Пик 1 в обоих анализах. Эти пики сохраняют одинаковую общую форму и время перемещения, и сходство увеличивается в стрессовых условиях в обоих анализах. Следовательно, предполагается, что Пик 1 содержит одинаковые виды в обоих анализах. Оба CE-SDS анализа способны обнаруживать небольшие фрагменты, как отмечено в таблице 17.

Пригодность для обнаружения фрагментов, образованным кислым гидролизом (кислые зажимы): длительное воздействие кислых условий может образовывать фрагменты, в частности, в последовательности Asp-Pro (остатки тяжелой цепи пертузумаба 272-273), как подтверждено масс-спектрометрическим анализом образцов, обработанных кислотой, показывающих массы на уровне 29039 Да (НС 1-272) и 21513Даа (НС 273-448 с G0 гликаном). Теоретические массы этих форм составляют 29031 Да и 21510 Да, соответственно. Исходя из ожидаемого времени перемещения этих форм, соответствующий пик можно ясно увидеть в CE-SDS анализе образца, обработанного кислотой, в редуцирующих условиях (Пик 2, Фиг. 34), но определяется на гораздо более низком уровне (более низкий сигнал) в анализе в нередуцирующих условиях. Можно предположить, что в NR-CE-SDS анализе фрагмент Пика 2, возможно, является дисульфид связанным, и, следовательно, не обнаруживаемым. Поскол(ку уровень Пика 2, детектируемого с помощью R-CE-SDS (5,58%) в образце, обработанном кислотой, превышает суммарные LMWS по данным SE-HPLC (0,26%) для этого образца, можно сделать вывод о том, что SE-HPLC также является недостаточным для детекции этих форм. Следовательно, CE-SDS анализ в редуцирующих условиях является единственным анализом, представленным в настоящей заявке, способный обнаружить фрагментацию, образовавшуюся как результат кислого гидролиза, как отмечено в таблице 17.

Пригодность для обнаружения фрагментов Fab/DesFab: существует хорошая линейная корреляция (r²=0,97) между LMWS, по данным SE-HPLC, и Пиком 3, полученным в результате CE-SDS анализа в нередуцирующих условиях (Фиг. 35). Было установлено, что LMWS содержат Fab фрагмент во время исследований ко-элюции с ферментативно полученным Fab. Аналогичным образом, Пик 3 и Пик 5 в NR-CE-SDS анализе были идентифицированы в время исследований совместного перемещения с ферментативно полученными Fab и DesFab, соответственно (Ma & Nashabeh, supra). Пик desFab является результатом расщепления тяжелой цепи, которая образует форму Fab, поэтому предполагают, что находится в эквивалентном молярном количестве (соответствует массовому соотношению 2:1) относительно Fab фрагмента, и, следовательно, информация об этой форме также может быть опосредовано получена с помощью SE-HPLC, как отмечено в таблице 17.

CE-SDS в редуцирующих условиях Пик 3: R-CE-SDS Пик 3 является единственным для пертузумаба и не наблюдался в CE-SDS анализе для других антител. Расширенная характеристика дает подтверждение выводу о том, что Пик 3 не является вариантом продукта или примесью, а скорее обусловленный способом артефакт, специфичный для пертузумаба, состоящего из диссоциируемой формы димера LC-LC. Были использованы многочисленные методики для характеристики Пика 3.

Пик 3 наблюдается с помощью R-CE-SDS с UV и LIF детекцией, что дает возможность предположить, что это не меченый красителем артефакт или артефакт получения образца.

При анализе с помощью R-CE-SDS, фракции легкой цепи очищенного пертузумаба образуют Пик 3, имеющий приблизительно 2-кратную кажущуюся молекулярную массу от теоретического размера LC.

Пик 3 не наблюдается в тех случаях, когда электрофоретические условия включают более высокую температуру капилляра, и в этих условиях не наблюдаются другие совместно перемещающиеся фрагменты.

Исследования, включающие единичные аминокислотные мутации, идентифицировали три аминокислотных остатка в LC CDR1 и CDR2, коррелирующие с образованием димера LC-LC. В тех случаях, когда любой из этих трех остатков заменяется другой аминокислотой, Пик 3 полностью диссоциирует и больше не наблюдается в CE-SDS в редуцирующих условиях.

SDS-PAGE анализ в сочетании с MALDI-TOF идентификаций белков по отпечаткам пептидных масс (PMF) подтвердил отсутствие белков клетки-хозяина в пертузумабе, и аналогичных полос, обнаруженных на уровнях, наблюдаемых с помощью CE-SDS.

Взятые вместе, эти результаты подтверждают идентификацию Пика 3 как обусловленного способом LC-LC димера, специфичного для пертузумаба.

Обсуждение

Оценка данных, полученных в результате этого исследования, показывает, что:

(1) NR-CE-SDS предоставляет неизбыточную информацию по сравнению с SE-HPLC для обнаружения фрагментов.

(2) Неизбыточная информация о фрагментации, полученная с помощью способа NR-CE-SDS (по сравнению с SE-HPLC) также может быть получена с использованием способа R-CE-SDS

Как показано в таблице 16, анализ в редуцирующих условиях обнаруживал продукты расщепления в результате воздействия низкого рН, что может иметь место во время производства лекарственного вещества. Таблица 18 содержит значения, полученные для Пика 1 и Пика 2 в CE-SDS в редуцирующих условиях для стандартного образца пертузумаба, вещества фазы III (n=3), и партий, полученных с использованием промышленного процесса производства (n=39). 95/99 допустимые интервалы (TI) были рассчитаны для Пика 1 и Пика 2, используя величину к 3,2, и представлены в таблице 18. Допустимый интервал 95/99 для Пика 1 составляет от 0,0 до 0,4%СРА. Допустимый интервал 95/99 для Пика 2 составляет от 0,3 до 0,9%СРА.

Окончательные критерии соответствия Пика 1≤0,5% и Пика 2≤1,0% в отношении высвобождения лекарственного вещества, выбраны в настоящем изобретении.

Поскольку лекарственное вещество пертузумаба хранят замороженным, не ожидается изменений в стабильности DS. Кроме того, исходя из данных R-CE-SDS, полученных для лекарственного препарата как при Т=0, так и T548d (таблица 19), значительного изменения не наблюдается для любого из названных видов.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ДЖЕНЕНТЕК, ИНК.

ГЕННАРО, ЛИНН А.

КАО, ЮН-СЯН

ЧЗАН, ЮНХУА

<120> ВАРИАНТЫ ПЕРТУЗУМАБА И ИХ АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

<130> P5584R1-WO

<141> 2014-04-15

<150> US 61/812,603

<151> 2013-04-16

<160> 24

<210> 1

<211> 195

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala

1 5 10 15

Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly

20 25 30

Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr

35 40 45

Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly

50 55 60

Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln

65 70 75

Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

80 85 90

Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr

95 100 105

Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu

110 115 120

Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg

125 130 135

Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile

140 145 150

Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn

155 160 165

Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser

170 175 180

Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg

185 190 195

<210> 2

<211> 124

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro

1 5 10 15

Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro

20 25 30

Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly

35 40 45

Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp

50 55 60

Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly

65 70 75

Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp

80 85 90

Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val

95 100 105

Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro

110 115 120

Cys Ala Arg Val

<210> 3

<211> 169

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val

1 5 10 15

Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe

20 25 30

Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala

35 40 45

Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu

50 55 60

Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro

65 70 75

Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile

80 85 90

Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln

95 100 105

Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu

110 115 120

Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe

125 130 135

Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln

140 145 150

Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly

155 160 165

Glu Gly Leu Ala

<210> 4

<211> 142

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro

1 5 10 15

Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys

20 25 30

Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val

35 40 45

Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln

50 55 60

Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val

65 70 75

Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys

80 85 90

Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys

95 100 105

Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys

110 115 120

Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu

125 130 135

Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr

140

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser

20 25 30

Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

95 100 105

Ile Lys

<210> 6

<211> 119

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly

1 5 10 15

Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr

20 25 30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu

35 40 45

Glu Trp Ile Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr

50 55 60

Asn Gln Arg Phe Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser

65 70 75

Ser Arg Ile Val Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr

95 100 105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

110 115

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser

20 25 30

Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

Ile Lys

<210> 8

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr

20 25 30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr

50 55 60

Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr

95 100 105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

110 115

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

Ile Lys

<210> 10

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu

95 100 105

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

110 115

<210> 11

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser

20 25 30

Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

110 115 120

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

125 130 135

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

140 145 150

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

155 160 165

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

170 175 180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

185 190 195

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn

200 205 210

Arg Gly Glu Cys

<210> 12

<211> 448

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr

20 25 30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr

50 55 60

Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr

95 100 105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

110 115 120

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

125 130 135

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

140 145 150

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

155 160 165

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

170 175 180

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

185 190 195

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

200 205 210

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

215 220 225

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

320 325 330

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

335 340 345

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

350 355 360

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

365 370 375

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

380 385 390

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

395 400 405

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

410 415 420

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

425 430 435

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

440 445

<210> 13

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn

20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

110 115 120

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

125 130 135

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

140 145 150

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

155 160 165

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

170 175 180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

185 190 195

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn

200 205 210

Arg Gly Glu Cys

<210> 14

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys

20 25 30

Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr

95 100 105

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

110 115 120

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

125 130 135

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

140 145 150

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

155 160 165

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

170 175 180

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

185 190 195

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

200 205 210

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

215 220 225

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

320 325 330

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

335 340 345

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

350 355 360

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

365 370 375

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

380 385 390

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

395 400 405

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

410 415 420

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

425 430 435

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

440 445

<210> 15

<211> 217

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 15

Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

1 5 10 15

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln

20 25 30

Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly

50 55 60

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

65 70 75

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

80 85 90

Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr

95 100 105

Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile

110 115 120

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

125 130 135

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

140 145 150

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser

155 160 165

Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

170 175 180

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

185 190 195

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

200 205 210

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

215

<210> 16

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr

20 25 30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr

50 55 60

Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr

95 100 105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

110 115 120

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

125 130 135

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

140 145 150

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

155 160 165

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

170 175 180

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

185 190 195

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

200 205 210

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

215 220 225

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

320 325 330

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

335 340 345

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

350 355 360

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

365 370 375

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

380 385 390

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

395 400 405

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

410 415 420

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

425 430 435

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

440 445

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<220>

<221> Xaa

<222> 10

<223> Xaa is preferrably D or S

<400> 17

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Xaa

5 10

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 18

Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 19

Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr

5 10

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 20

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala

5 10

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<220>

<221> Xaa

<222> 5

<223> Xaa is preferably R or L

<220>

<221> Xaa

<222> 6

<223> Xaa is preferably Y or E

<220>

<221> Xaa

<222> 7

<223> Xaa is preferably T or S

<400> 21

Ser Ala Ser Tyr Xaa Xaa Xaa

5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 22

Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr

5

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 23

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp

5 10

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Sequence is synthesized.

<400> 24

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

5

<---

Группа изобретений относится к лечению злокачественного заболевания. Композиция для лечения злокачественного заболевания содержит эффективное количество пертузумаба и его варианта с неспаренными цистеинами, где указанный вариант с неспаренными цистеинами содержит Cys23 и Cys88 в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба и Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах его легкой цепи. Также раскрыты фармацевтическая композиция для лечения злокачественного заболевания, изделие для лечения злокачественного заболевания, выделенный вариант пертузумаба для лечения злокачественного заболевания и другой вариант композиции для лечения злокачественного заболевания. Группа изобретений обеспечивает расширение арсенала средств определенного назначения. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 45 ил., 19 табл., 6 пр.

1. Композиция для лечения злокачественного заболевания, содержащая эффективное количество пертузумаба и его варианта с неспаренными цистеинами, где указанный вариант с неспаренными цистеинами содержит Cys23 и Cys88 в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба и Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах его легкой цепи.

2. Композиция по п. 1, где указанный вариант с неспаренными цистеинами представляет собой гетеродимерный вариант, содержащий Cys23/Cys88 неспаренные цистеины только в одном вариабельном домене легкой цепи пертузумаба.

3. Композиция по п. 1, где указанный вариант с неспаренными цистеинами представляет собой гомодимерный вариант, содержащий Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба.

4. Композиция по п. 1, где пертузумаб и указанный вариант с неспаренными цистеинами каждый содержат вариабельные аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи в SEQ ID No. 7 и 8 соответственно.

5. Композиция по п. 4, где пертузумаб и указанный вариант с неспаренными цистеинами, каждый, содержат аминокислотную последовательность легкой цепи в SEQ ID No. 11 или 15 и аминокислотную последовательность тяжелой цепи в SEQ ID No. 12 или 16.

6. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая один или более дополнительных вариантов пертузумаба, где дополнительные варианты выбраны из группы, состоящей из: варианта, лишенного фукозы, разновидностей с низкой молекулярной массой (LMWS), разновидностей с высокой молекулярной массой (HMWS), гликозилированного варианта, варианта с восстановленным дисульфидом, невосстанавливаемого варианта, дезамидированного варианта, сиалилированного варианта,VHS-варианта, варианта с С-концевым лизином, варианта с окисленным метионином, варианта гликозилирования G1, варианта гликозилирования G2 и варианта с негликозилированной тяжелой цепью.

7. Композиция по п. 1, где количество указанного варианта с неспаренными цистеинами в композиции составляет ≤примерно 25% по данным Fab хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC).

8. Композиция по п. 3, где количество гомодимерного варианта в композиции составляет ≤4,9% по данным хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC) интактного антитела.

9. Композиция по п. 2, где количество гетеродимерного варианта в композиции составляет примерно от 13% до примерно 18% по данным хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC) интактного антитела.

10. Композиция по п. 1, которая подвергалась аналитическому анализу для подтверждения того, что количество указанного варианта с неспаренными цистеинами в композиции составляет ≤примерно 25% по данным Fab хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC).

11. Композиция по п. 10, дополнительно содержащая вариант пертузумаба, лишенный фукозы, где количество варианта, лишенного фукозы, превышает 2% и до 4,1% композиции.

12. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественного заболевания, содержащая эффективное количество композиции по п. 1, и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

13. Изделие для лечения злокачественного заболевания, содержащее контейнер с фармацевтической композицией по п. 12 и лист-вкладыш с указаниями по применению препарата, информирующими пользователя о применении фармацевтической композиции для лечения пациента, страдающего злокачественным заболеванием.

14. Выделенный вариант пертузумаба для лечения злокачественного заболевания, где выделенный вариант содержит: (а) вариант пертузумаба с неспаренными цистеинами, где вариант представляет собой гетеродимерный вариант, содержащий Cys23 и Cys88 в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба и Cys23/Cys88 неспаренные цистеины только в одном вариабельном домене его легкой цепи; или (b) вариант пертузумаба с неспаренными цистеинами, где вариант представляет собой гомодимерный вариант, содержащий Cys23 и Cys88 в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба и Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в обоих вариабельных доменах его легкой цепи.

15. Композиция для лечения злокачественного заболевания, содержащая эффективное количество пертузумаба, и (а) его варианта с неспаренными цистеинами, где указанный вариант с неспаренными цистеинами содержит Cys23 и Cys88 в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба и Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах его легкой цепи, и (b) варианта пертузумаба, лишенного фукозы, где количество варианта, лишенного фукозы, превышает 2% и до 4,1% композиции.