Способ выявления химерных транскриптов гена EWSR1, ассоциированных с саркомой Юинга Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области молекулярной диагностики и может быть использовано для выявления транскриптов гена EWSR1 с целью диагностики саркомы Юинга.

Саркома Юинга (СЮ) представляет собой остеолитическое злокачественное новообразование, отличающееся крайне быстрым возникновением метастазов в легких, головном мозге, висцеральных органах. Преимущественно возникает у детей и подростков 10-15 лет, но также может встречаться у людей старшего и пожилого возраста [1]. Она составляет 10-15% всех первичных злокачественных неоплазий костной ткани у детей [2]. По данным ВОЗ, СЮ является наиболее распространенной детской опухолью костей и диагностируется с частотой 0,5 на 100000 населения ежегодно [3]. Риск возникновения заболевания повышается в период полового созревания, а также в период активного роста скелета. В 30% случаев опухоль локализуется в длинных трубчатых костях нижних конечностей, а именно в диафизе кости. К редким локализациям относится поражение ребер (6,5%), позвонков (5%), костей черепа (4%) и пястных костей (3,8%). Крайне редко поражается эпифиз трубчатых костей [3,4].

К семейству саркомы Юинга относятся также высокоагрессивные злокачественные новообразования, поражающие в основном костную ткань – примитивные нейроэктодермальные опухоли (PNETs), опухоль Аскина, внескелетная саркома Юинга [5]. Все опухоли данного семейства имеют схожий нейрогенный фенотип и возникают вследствие одной и той же хромосомной транслокации. Поэтому их рассматривают как варианты одной опухоли, имеющие разные степени дифференцировки [6].

В лечении рассматриваемых опухолей используются стандартные химиотерапевтические методы, которые являются весьма токсичными, вызывают много нежелательных побочных эффектов и далеко не всегда эффективны. Поэтому в настоящее время разрабатываются новые терапевтические подходы, к которым можно отнести ингибитор РНК-геликазы A (YK-4-279), который связывается с онкогенным белком EWSR1/FLI1, являющимся драйвером возникновения СЮ, что препятствует активации транскрипции, вызванной EWSR1/FLI [7]. Данный препарат сейчас находится на I фазе клинических исследований [NCT02657005].

Более 85% СЮ возникают вследствие транслокации t (11; 22) (q24; q12), в результате которой ген EWSR1, расположенный на длинном плече 22-й хромосомы, соединяется с геном FLI1, расположенным на длинном плече 11-й хромосомы. Более редко (10%-15% случаев) встречаются альтернативные транслокации, приводящие к слиянию гена EWSR1 с другими факторами транскрипции ETS: ERG, ETV1, ETV4, FEV и др. Всего описано около 20 различных типов транслокаций, характерных для СЮ и PNETs. Наиболее часто встречаются слияния генов EWSR1 и FLI1, EWSR1 и ATF1, EWSR1 и ERG, составляя около 75% от числа всех транслокаций. Более половины всех сарком Юинга имеют слияние типа I, при котором происходит соединение 5’-области мРНК EWSR1 экзона 7, с 3’-областью мРНК FLI1 экзона 5. Примерно в 25% случаев происходят слияния типа II, при котором экзон 6 FLI1 является партнером для экзона 7 EWSR1 [7].

Транслокация t (22; 11)(q; 24; 12) в дальнейшем приводит к экспрессии химерного онкопротеина EWSR1/FLI1, который уникально экспрессируется во всех опухолевых клетках и поддерживает их выживание [8,9]. Слияние EWSR1/FLI1 присутствует только в клетках СЮ и не существует ни в одной нормальной клетке организма. Таким образом, СЮ содержат уникальный белок, генерируемый опухолеспецифической транслокацией, который может служить мишенью для разработки таргетных препаратов, а описанная транслокация является специфичным диагностическим маркером [10].

В настоящее время для обнаружения транслокации доступны различные методы. Среди них флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) является наиболее часто используемой в рутинной клинической диагностике. Однако FISH метод имеет ряд недостатков, к которым относится трудоемкость и моноплексность (выявление только одного транскрипта с помощью одной гибридизационной пробы). Для повышения информативности требуется проведение множественных гибридизаций, что существенно удлиняет время, отведенное на диагностику. Также отсутствие специального оборудования, необходимого для проведения данного метода в большинстве лабораторий, существенно снижает возможности диагностики. Кроме того, иногда бывает трудно выбрать конкретный зонд для FISH-теста, в случае неясного морфологического диагноза.

Поэтому разработка оптимального метода диагностики СЮ на сегодняшний день является актуальной задачей. Обнаружение одного из нескольких патогномоничных химерных транскриптов, лежащих в основе патогенеза сарком, является золотым стандартом диагностики. Это обуславливает обоснованность применения различных молекулярно-генетических методов для их выявления.

Молекулярные методы уже повсеместно включаются в рутинную диагностику.

Например, известен способ выявления транслокаций с помощью мультиплексной ПЦР и последующего высокопроизводительного секвенирования (NGS) (Archer Fusion Plex Sarcoma kit позволяет выявить перестройки сразу 26 генов). Обнаружение транслокаций с помощью целевого NGS на основе мультиплексной ПЦР показало удовлетворительные результаты по сравнению с традиционными FISH и RT-PCR на FFPE тканях при условии соблюдения критериев адекватного качества материала [11].

Известен способ выявления транскриптов EWSR1/ERG, EWSR1/FLI с помощью RT-PCR с раздельной стадией обратной транскрипции с детекцией результатов с помощью капиллярного электрофореза, при этом длина апликонов составляла около 200 п.н, что снижает чувствительность и эффективность RT-PCR. В качестве контроля выделения нуклеиновых кислот использовали амплификацию кДНК гена β-актина (ACTB) [12].

Известен способ выявления транскриптов EWSR/FLI1, EWSR1/ERG, и EWSR1/FEV с помощью RT-PCR с раздельной стадией обратной транскрипции с детекцией результатов с помощью электрофореза в 2%-номагарозном гель-электрофорезе. При этом длина ампликонов составляла около 250 п.н., что также снижает эффективность проводимой реакции амплификации. В качестве контроля выделения использовали амплификацию кДНК гена β-актина (ACTB) [13].

Известен способ выявления транскрипта EWSR1/FLI1 с помощью «вложенной» PCR с раздельной стадией обратной транскрипции с детекцией результатов с помощью электрофореза также на 2%-ном агарозном геле, что трудоемко и имеет низкую чувствительность [14].

Известен способ выявления транскриптов EWS/FLI1, EWS/ERG, EWS/ETV1 с помощью RT-PCR с раздельной стадией обратной транскрипции. Для детекции ампликонов использовали интеркалирующий краситель SYBR Green I, что может уменьшать специфичность детекции. При этом длина ампликонов была достаточно небольшой: от 80 до 166 п.н [15].

Патентов, описывающих выявление химерных транскриптов гена EWSR1 с помощью метода Real-time PCR, не было найдено.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ выявления транскрипта EWSR1/FLI с помощью RT-PCR с раздельной стадией обратной транскрипции с детекцией результатов с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Нуклеиновые кислоты выделяли при помощи набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). При этом длина ампликонов составляла от 150 до 200 п.н. В качестве контроля выделения нуклеиновых кислот использовали амплификацию кДНК гена фосфоглицераткиназы (PGK) [16].

Недостатками известного способа являются проведение раздельной стадии обратной транскрипции, что значительно удлиняет время проведения анализа, а также выбранная длина ампликонов в районе 150-200 п.н., что существенно снижает эффективность амплификации.

Задачей изобретения является разработка менее трудоемкого и более быстрого способа выявления молекулярных перестроек гена EWSR1, обладающего высокой чувствительностью.

Технический результат: уменьшение длительности способа с сохранением высокой чувствительности диагностики, что является важным преимуществом для анализа нуклеиновых кислот, выделенных из парафиновых блоков.

Поставленная задача достигается путем проведения одностадийной Real-time PCR с детекцией продуктов амплификации специфическими флуоресцентными зондами (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:15) для дифференциальной диагностики саркомы Юинга с максимальным сокращением времени анализа.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

Для анализа используют образцы РНК, выделенные из фиксированной ткани саркомы Юинга в парафиновых блоках. Для выделения РНК используют свежеприготовленные срезы FFPE тканей толщиной 5 мкм, помещенные в пробирку объемом 1.5 мл. После депарафинизации тканей проводят выделение РНК методом фенол-хлороформной экстракции [17]. Образцы РНК, выделенные из фиксированной ткани саркомы Юинга в парафиновых блоках, подвергают одностадийной Real-time PCR с сопряженной реакцией обратной транскрипции. Для оценки успешности выделения РНК, стадий обратной транскрипции и амплификации используют амплификацию фрагмента кДНК гена Bcl-XL.

Уровень экспрессии генов в ходе проведения одностадийной Real-time PCR, сопряженной с реакцией обратной транскрипции, определяют на амплификаторе Light Cycler 96 (Roche, Швейцария) и Cfx 96 (Bio-Rad). Набор праймеров, используемых для детекции химерных транскриптов гена EWSR1, включает прямые праймеры с последовательностями SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13 и обратные праймеры с последовательностями SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14, а также зонды с последовательностями SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:15, представленные в перечне последовательностей.

Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1) стадию обратной транскрипции (ОТ) и полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени проводят в одной реакционной смеси, что позволяет существенно уменьшить длительность и трудоемкость способа;

2) накопление продуктов амплификации детектируют при помощи оригинальных олигонуклеотидных проб длиной 20-23 п.н., на 5'-конце которых находится флуорофор (HEX), а на 3'-конце тушитель флуоресценции (BHQ-2), что обеспечивает максимальное уменьшение длины ампликона и приводит к увеличению эффективности амплификации, повышению чувствительности анализа;

3) используют наборы праймеров и зондов, включающие прямые праймеры с последовательностями SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13, обратные праймеры с последовательностями SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14, а также зонды с последовательностями SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:15, которые фланкируют область разрыва двух генов - fusion, расположенную между участками гена EWSR1 и гена ETS-семейства (FLI1, ATF1, ERG, NRA3, CREB1).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выявление наиболее распространенного химерного транскрипта EWSR/FLI в FFPE блоках, содержащих ткань саркомы Юинга.

Для выделения РНК использовали свежеприготовленные срезы FFPE тканей толщиной 5 мкм, помещенные в пробирку объемом 1.5 мл. Для депарафинизации тканей в пробирку со срезами добавляли 500 мл минерального масла (Paraffin oil light), после чего инкубировали при 5 мин при 80⁰С. Далее добавляли 200 мкл буфера А, 20 мкл proteinase К, перемешивали, скидывали капли на дно пробирки кратковременным центрифугированием на вортексе, инкубировали при 65^оС 12 ч. После растворения осадка добавляли 200 мкл фенола, уравновешенного ТЕ, 200 мкл хлороформа, тщательно перемешивали до образования однородной эмульсии, инкубировали на льду в течение 10 мин. После этого центрифугировали в течение 10 мин при 13000 g. Далее 180 мкл верхней водной фазы переносили в чистые пробирки, содержащие 5 мкл линейного полиакриламида, 20 мкл 2М NaAc, перемешивали, добавляли 200 мкл изопропилового спирта. Полученный раствор инкубировали 1 час при температуре -20^оС. Далее центрифугировали в течение 12 мин при 13 000 g. После этого удаляли супернатант, а оставшийся осадок дважды промывали 500 мкл буфера В. Далее сушили осадок в термостате при 37^оС с открытыми крышками пробирок в течение 10 мин. Осадок растворяли в 80 мкл 5 mM Tris HCl pH 8,0 при 65^оС в течение 20 мин. Немедленно использовали полученные препараты нуклеиновых кислот для анализа или хранили при -70^оС.

Образцы РНК, выделенные из фиксированной ткани саркомы Юинга в парафиновых блоках, были подвергнуты одностадийной Real-time PCR, сопряженной с реакцией обратной транскрипции. Список обнаруженных перестроек приведен в таблице 1. Всего было проанализировано 30 образцов саркомы Юинга (СЮ).

Таблица 1

№ Блок Тип опухоли Ct(Bcl-XL) Ct Fusion 1 24209/11 саркома Юинга 31,52 34,56 EWSR1/FLI 2 2464/07 саркома Юинга 34,64 34,94 EWSR1/FLI 3 3735/06 саркома Юинга 34,17 33,35 EWSR1/FLI 4 29541/06 саркома Юинга 34,25 32,08 EWSR1/FLI 5 16942/11 саркома Юинга 28,97 31,49 EWSR1/FLI 6 16879/05 саркома Юинга 29,13 31,02 EWSR1/FLI 7 25167/08 саркома Юинга 30,54 31,65 EWSR1/FLI 8 21456/05 саркома Юинга 31,62 33,42 EWSR1/FLI 9 24578/06 саркома Юинга 30,28 31,15 EWSR1/FLI 10 32114/05 саркома Юинга 31,13 34,23 EWSR1/FLI 11 21357/05 саркома Юинга 32,11 33,24 EWSR1/FLI 12 26549/06 саркома Юинга 32,58 31,19 EWSR1/FLI 13 23477/07 саркома Юинга 29,27 31,25 EWSR1/FLI 14 25965/08 саркома Юинга 28,65 30,52 EWSR1/FLI 15 32845/11 саркома Юинга 29,98 30,75 EWSR1/FLI

Для всех образцов была показана амплификация кДНК гена Bcl-XL, а также идентифицирована транслокация EWSR1/FLI по наличию амплификации со специфическими праймерами и зондами. Наглядный пример результатов проведения одностадийной Real-time PCR образца РНК, выделенного из FFPE ткани саркомы Юинга, представлен на фиг. 1, где кривые накопления флуоресцентного сигнала свидетельствуют о наличии перестройки EWSR1/FLI1 в образце СЮ.

Пример 2. Выявление химерных транскриптов гена EWSR1 и гена ETS-семейства (ATF1, ERG, NRA3, CREB1) в FFPE блоках, содержащих ткань саркомы Юинга

Образцы РНК были выделены из FFPE блоков аналогично примеру 1. Далее проводили одностадийную Real-time PCR с сопряженной реакцией обратной транскрипции. Для оценки успешности выделения РНК, стадий обратной транскрипции и амплификации использовали амплификацию фрагмента кДНК гена Bcl-XL. Список обнаруженных перестроек приведен в таблице 2. Всего было проанализировано 30 образцов саркомы Юинга (СЮ).

Таблица 2

№ Блок Тип опухоли Ct(Bcl-XL) Ct Fusion 1 8244/16 саркома Юинга 30,51 35,52 EWSR1/ERG 2 1351/17 саркома Юинга 31,08 32,94 EWSR1/ATF1 3 8700/08 саркома Юинга 35,30 35,10 EWSR1/ATF1 4 1254/08 саркома Юинга 30,18 32,51 EWSR1/ERG 5 1564/15 саркома Юинга 32,87 34,57 EWSR1/CREB1 6 1345/06 саркома Юинга 31,67 31,75 EWSR1/ATF1 7 12548/08 саркома Юинга 29,47 30,27 EWSR1/ATF1 8 1265/09 саркома Юинга 31,78 32,11 EWSR1/NRA3 9 6254/17 саркома Юинга 31,95 32,24 EWSR1/ERG 10 1785/11 саркома Юинга 33,37 34,12 EWSR1/NRA3 11 32569/05 саркома Юинга 30,75 31,98 EWSR1/ERG 12 1498/05 саркома Юинга 28,82 30,02 EWSR1/CREB1 13 6254/07 саркома Юинга 29,49 31,19 EWSR1/ERG 14 8452/09 саркома Юинга 29,31 32,87 EWSR1/NRA3 15 8704/07 саркома Юинга 31,77 30,69 EWSR1/CREB1

Для всех образцов была показана амплификация кДНК гена Bcl-XL, а также идентифицированы транслокации EWSR1/ATF1, EWSR1/ERG, EWSR1/CREB1, EWSR1/NRA3 по наличию амплификации со специфическими праймерами и зондами. Наглядный пример результатов проведения одностадийной Real-time PCR образца РНК, выделенного из FFPE ткани саркомы Юинга, представлен на фиг. 2, где кривые накопления флуоресцентного сигнала свидетельствуют о наличии перестройки EWSR1/ATF1 в образце СЮ.

Использование предлагаемого способа позволит уменьшить время тестирования с сохранением высокой чувствительности диагностики, что является важным преимуществом для анализа нуклеиновых кислот, выделенных из парафиновых блоков.

Источники информации

1. Каприн А.Д., Распространенность злокачественных новообразований в России в 2007-2017 гг. // Состояние онкологической помощи населению России в 2017 году. Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена. - 2018. - 18 с.

2. Michaela C. Robust diagnosis of Ewing sarcoma by immunohistochemical detection of super-enhancer-driven EWSR1-ETS targets // Oncotarget. - 2017. - V. 9 - N 1. - P. 1587-1601.

3. Клинические рекомендации. Саркома Юинга у детей. (утв. Минздравом России). - 2017. - 15-18 с.

4. Кекеева Т.В. Анализ химерных онкогенов SYT/SSX1 и SYT/SSX2 при синовиальной саркоме // Молекулярная биология.- 2013. - Т. 45. - № 5.- С. 840-844.

5. Шалыга И.Ф., Ачинович С.Л. Саркома Юинга // Медицина и здравоохранение.- 2018. - Т.5.- № 54.- С. 102-105.

6. Miettinen M., Cupo W. Neural cell adhesion molecule distribution in soft tissue tumors // Human Pathology.–1993. – V. 24.– N 1. – P. 62-66.

7. Ingrid M. E. Desar. Systemic Treatment for Adults with Synovial Sarcoma // Curr Treat Options Oncol. - 2018. - V. 19 - N 2. - P. 22—28.

8. Catalog Of Somatic Mutations in Cancer, 2020

9. Denduluri S.K. Insulin-like growth factor (IGF) signaling in tumorigenesis and the development of cancer drug resistance. - 2015. - V. 2 - N 7. - P. 13-25.

10. Gaspar N. Ewing sarcoma: current management and future approaches through collaboration // J.Clin.Oncol. – 2015. – V. 33 – N 27. – P. 3036–3046.

Suk Wai Lam11. . Molecular Analysis of Gene Fusions in Bone and Soft Tissue Tumors by Anchored Multiplex PCR–Based Targeted Next-Generation Sequencing // The Journal of Molecular Diagnostics. Vol. 20,No 5, 2018, P. 653-663

12. Barbara Patócs. Utilisation of fluorescent multiplex PCR and laser induced capillary electrophoresis for the diagnosis of Ewing family of tumours in formalin-fixed paraffin-embedded tissues // J Clin Pathol. 2012; 65:1112–1118

13. Gamberi G. Molecular Diagnosis in Ewing Family Tumors// Molecular Diagnostics. - 2011. - V. 13 - N 3 - P.313–324.

14. Montoya C. Epigenetic control of the EWS/FLI1 promoter in Ewing's sarcoma//Oncology Reports 43: 1199-1207, 2020

15. Tracey B. L. Differentiating Ewing' sarcoma from other round blue cell tumors using a RT-PCR translocation panel on formalin-fixed paraffin-embedded tissues // Modern Pathology. - 2016. - V. 20 - N 5. - P. 397–404.

16. Berková A. A comparison of RT-PCR and FISH techniques in molecular diagnosis of Ewingʼs sarcoma in paraffin-embedded tissue/Čes.-slov. Patol. 44, 2008, No. 3, p. 67–70

17. Zumbo P. Phenol-chloroform Extraction. Weill Cornell Medical College.

--->

Перечень последовательностей

SEQ ID NO: 1

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт

химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения

Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН)

<120> Cпособ выявления химерных транскриптов гена EWSR1, ассоциированных

с саркомой Юинга.

<160> 15

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

CGTTTGTGCCCCTCCAAGG 19

SEQ ID NO: 2

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

CAACAGAGCAGCAGCTACGG 20

SEQ ID NO: 3

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

TCTGGCCTCAACAAAAGTCCTC 22

SEQ ID NO: 4

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

CTGTGCCTGGACTTGCCAAC 20

SEQ ID NO: 5

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

CAACAGAGCAGCAGCTACGG 20

SEQ ID NO: 6

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

CATTGCCCCAAATGGAGCCTTA 22

SEQ ID NO: 7

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

TCGGTACCATTGTTAGCCAGCT 22

SEQ ID NO: 8

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

CAACAGAGCAGCAGCTACGG 20

SEQ ID NO: 9

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

CATTACCCAGGGAGGAGCAAT 21

SEQ ID NO: 10

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

TGGGGTGGCCGTGACCGG 18

SEQ ID NO: 11

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

CAACAGAGCAGCAGCTACGG 20

SEQ ID NO: 12

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

TTACCATATGAGCCCCCCAGGA 22

SEQ ID NO: 13

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

GTGTGGGAGGTTGTATTATAGG 22

SEQ ID NO: 14

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

CAACAGAGCAGCAGCTACGG 20

SEQ ID NO: 15

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

CTCAGGGAAAGTTCACTGCTG 21

<---

Изобретение относится к биотехнологии, способ включает в себя совмещенную обратную транскрипцию образцов РНК, выделенных из фиксированной формальдегидом ткани в парафиновых блоках, и амплификацию их кДНК в режиме реального времени с использованием разработанного набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов. Изобретение позволяет проводить дифференциальную диагностику саркомы Юинга, обеспечивает уменьшение времени, затрачиваемого на проведение анализа, и снижение его стоимости. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Способ выявления химерных транскриптов гена EWSR1, ассоциированных с саркомой Юинга, включающий проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с обратной транскрипцией (ОТ), отличающийся тем, что полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени и стадию обратной транскрипции (ОТ) проводят в одной реакционной смеси, накопление продуктов амплификации детектируют в режиме реального времени при помощи набора праймеров и зондов, включающего прямые праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, обратные праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, а также зонды с последовательностями SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве матрицы для амплификации используют фрагмент кДНК гена Bcl-XL.