Способ профилактики или терапии острого респираторного дистресс-синдрома на модели индуцированного ОРДС у лабораторных животных Российский патент 2022 года по МПК A61K38/10 A61P11/00 A61K49/00 

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно фармацевтике и иммунологии.

Синдром острого повреждения легких (СОПЛ) и его наиболее тяжелое проявление, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) - это клинический синдром, проявляющийся воспалительным поражением легких, характеризующийся диффузным нарушением альвеолярных эндотелиальных и эпителиальных барьеров, нейтрофильной инфильтрацией в легочных участках и тяжелой гипоксемией при отсутствии признаков кардиогенного отека легких.

СОПЛ вместе с ОРДС являются респираторными синдромами, связанными с высокой смертностью и заболеваемостью, вызванными множеством причин, чаще всего - пневмонией, травмой и сепсисом.

Это заболевание может быть вызвано множеством факторов, которые напрямую или косвенно поражают легкие.

Впервые клинические проявления ОРДС были описаны в 1967 году.

В дальнейшем это состояние получало множество других названий - «некардиогенный отек легких», «мокрое легкое», «тяжелое легкое», «шоковое легкое».

На настоящий момент под ОРДС понимают такой тип дыхательной недостаточности, при котором стремительно развивается обширный воспалительный процесс в легких, сопровождающийся одышкой, учащенным дыханием и синеватой окраской кожи.

Основной подход к лечению ОРДС включает в себя вентиляционную помощь и поддержку сердечно-сосудистой системы с последующим применением глюкокортикостероидов и заместительной терапией сурфактантом (см. Клинические рекомендации. Диагностика и интенсивная терапия ОРДС. Утверждены Президиумом Общероссийской общественной организацией «Федерация анастезиологов-реаниматологов». Утверждены 30.03.2021, рекомендация 67 стр. 62-63, стр. 7, рекомендация 57 стр. 55 - далее [1]).

Однако не во всех случаях установившийся подход дает положительные результаты. Поэтому поиск новых, эффективных, обладающих благоприятным профилем безопасности, средств для лечения ОРДС на сегодняшний день является актуальной задачей для специалистов в данной области.

Решение этой задачи возможно путем моделирования воспалительных заболеваний легких у лабораторных животных путем эндотрахеального введения им веществ, индуцирующих воспалительный процесс и последующего исследования результатов применяемой для их лечения терапии.

Из уровня техники известен способ моделирования заболеваний легких на лабораторных животных путем эндотрахеального введения им липополисахаридов (ЛПС) и/или физиологического раствора (см. Thomas Tschernig and other. Lipopolysaccharide induced inflammation in the perivascular space in lungs. Journal of Occupational Medicine and Toxicology volume 3, Article number: 17 (2008), published: 30 July 2008 - далее [2]).

Использование в способе [2] липополисахарида (ЛПС), который представляет собой токсичный агент, вызывающий воспаление легких, позволяет достичь при моделировании легочных заболеваний у лабораторных животных миграции нейтрофилов и моноцитов в альвеолы и, следовательно, достичь ярко выраженного воспалительного процесса.

Недостатком данного способа является то, что способ не позволяет определить кинетику превращения клеток в легких лабораторных животных, получавших ЛПС, а также ограниченность его применения для моделирования ОРДС.

Ближайшим аналогом к заявленной группе изобретений является способ оценки действия экспериментальной профилактики и/или терапии острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) на модели ОРДС у лабораторных животных заключающийся в моделировании индуцированного острого респираторного дистресс-синдрома с помощью липополисахарида путем его эндотрахеального введения лабораторным животным и последующей экспериментальной терапии ОРДС экстракорпоральной мембранной оксигенацией, описанный в источнике информации - Andrea Fiala and others. Treatment of a Rat Model of LPS-Induced ARDS via Peritoneal Perfusion of Oxygen Microbubbles. Journal of surgical research. 13.09.2019 - далее [3]).

Данное решение не позволяет собрать достаточное количество результатов исследования для их статистической обработки, а также содержит сведения о неудовлетворительных результатах применяемой терапии ОРДС.

Задача настоящего изобретения заключается в создании нового, эффективного средства с достаточным для статистической обработки количеством регистрируемых эффектов при проведении эффективной терапии лекарственным средством, обладающим благоприятным профилем безопасности для лечения ОРДС.

Технический результат изобретения заключается в снижении риска зависимости результатов терапии от способов введения лекарственного средства; снижении токсических эффектов терапии ОРДС; в повышении резистентности организма при лечении ОРДС в отношении инфекций, вызванных вирусами, бактериями и грибами; в ингибировании воспалительных цитокинов, обуславливающих ОРДС; в снижении инфильтрации лейкоцитов; снижении секреции муцина; снижении уровней провоспалительных цитокинов TNFα и IL-6; в снижении процентного соотношения нейтрофильных гранулоцитов и одновременном увеличении доли макрофагов; снижении риска присоединения оппортунистической инфекции при терапии ОРДС, снижении риска синергического подавления иммунитета при терапии ОРДС.

Технический результат в заявленном изобретении достигается в способе оценки действия экспериментальной профилактики или терапии острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) на модели ОРДС у лабораторных животных, заключающийся в моделировании индуцированного ОРДС с помощью липополисахарида путем его эндотрахеального введения лабораторным животным с последующим индуцированием воспалительного клеточного сигнального пути и применением экспериментальной профилактики и/или терапии ОРДС, заключающейся во введении до или после моделирования ОРДС лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu в дозе от 0,2 мг до 1 мг на каждое животное, причем способ включает следующие стадии:

- моделирование индуцированного ОРДС путем введения липополисахарида в дозе от 1 до 15 мг/кг на каждое животное;

- измерение через 48 часов после введения липополисахарида уровня провоспалительного цитокина TNFα в сыворотке крови, уровней провоспалительного цитокина IL-6 и лейкоцитов в бронхоальвеолярном лаваже, а также уровня муцина MUC5AC в гомогенате легкого; и

- при снижении уровня провоспалительного цитокина TNFα в сыворотке крови животных до 59,11 - 235,71 пг/мл, снижении уровня провоспалительного цитокина IL-6 до 0,641-2,034 пг/мкг белка в бронхоальвеолярном лаваже животных, снижении уровня лейкоцитов в бронхоальвеолярном лаваже животных до 0,51-5,69×10⁶ клеток/мл с преобладанием фракции нейтрофильных гранулоцитов до 80-90%, снижении уровня муцина MUC5AC в гомогенате легкого до 11,7 - 27,62 нг/мг оценивают эффективность лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu для экспериментальной профилактики и/или терапии ОРДС.

Технический результат в заявленном изобретении достигается в способе оценки действия экспериментальной профилактики или терапии на модели ОРДС у лабораторных животных, в котором экспериментальную профилактику ОРДС проводят у лабораторных животных лекарственным средством на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu, путем его двукратного введения за 24 часа и 16 часов до моделирования.

Технический результат в заявленном изобретении достигается в способе оценки действия экспериментальной профилактики или терапии на модели ОРДС у лабораторных животных, в котором экспериментальную терапию ОРДС проводят у лабораторных животных лекарственным средством на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu, путем его последовательного введения животному через 1 час, 8 часов, 25 часов и 33 часа после моделирования ОРДС.

Технический результат в заявленном изобретении достигается в способе оценки действия экспериментальной профилактики или терапии на на модели ОРДС у лабораторных животных, в котором введение лабораторным животным лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu осуществляют путем его внутривенного или внутримышечного, или эндотрахеального введения.

Эффективность лекарственного препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu в отношении ОРДС была проверена на модели ЛПС (липополисахарид)-индуцированного ОРДС у крыс.

Эндотоксин ЛПС клеточной оболочки грамотрицательных бактерий присутствует в различных частицах, таких как табачный дым, бытовая и промышленная пыль. Вдыхание ЛПС человеком и его эндотрахеальное введение животным в экспериментальной модели, вызывает воспаление дыхательных путей. ЛПС индуцирует воспалительный клеточный сигнальный путь за счет связи с толл-подобными рецепторами 4-го типа (TLR4) и другими молекулами, такими как CD14 (кластер дифференцировки 14) и лимфоцитарный антиген 96 (LY96, также известный как MD2 белок). В легких животных под действием ЛПС увеличивается миграция нейтрофилов и моноцитов за счет сложного взаимодействия цитокинов, хемокинов и молекул адгезии.

В данном исследовании ОРДС у крыс был индуцирован путем однократного эндотрахеального введения ЛПС от 1 до 15 мг/кг.

В качестве тест-системы были использованы самцы крысы линии Wistar в количестве 255 особей, которых успешно применяют в токсикологических экспериментах, а также при моделировании патологий с помощью введения ЛПС.

Общее количество животных для проведения исследований составило 200. Это количество явилось достаточным для того, чтобы оценить характер и частоту проявления регистрируемых эффектов.

Одновременно такое количество животных является минимальным с точки зрения этических принципов.

На каждой временной точке эвтаназии у животных отбирали кровь из сердца для получения сыворотки и бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ). Непосредственно после забора биологического материала у крыс извлекали легкие для макроскопической оценки острого повреждения легких. Бронхоальвеолярный лаваж отбирали трехкратным промыванием легких через трахею фосфатно солевым раствором с 0,1 mM ЭДТА, суммарный объем 3 мл. Определяли общее количество лейкоцитов (с помощью гематологического анализатора) и лейкоформулу (с помощью гематологического анализатора и микроскопии мазка) в образцах БАЛ. В сыворотке крови и в образцах БАЛ определяли уровни IL-6 и TNFα.

Для осуществления изобретения была сформирована модель ОРДС у самцов крыс линии Wistar путем эндотрахеального введения липополисахарида (ЛПС) бактериальной стенки Е. coli в дозах от 1 до 15 мг/кг.

Эндотрахеальное введение ЛПС в дозе от 1 до 15 мг/кг привело к значимому увеличению уровня лейкоцитов в БАЛ через 48 ч с преобладанием пула нейтрофильных гранулоцитов (83% по медианному значению) и снижением доли макрофагов.

В сыворотке крови животных контрольной группы через 4 ч после индукции патологии наблюдалось значимое увеличение уровня одного из главных медиаторов острого воспаления - TNFα - до 214 пг/мл. В бронхоальвеолярном лаваже через 48 ч наблюдалось статистически значимое в сравнении с интактной группой увеличение уровня провоспалительного цитокина IL-6 до 1,8 пг/мкг белка.

В гомогенатах легких наблюдалось значимое увеличение в 3 раза уровня муцина MUC5AC, что коррелировалось с гиперплазией бокаловидных клеток при микроскопии ткани легкого.

Микроскопический анализ ткани легкого подтвердил наличие острого воспалительного процесса по совокупности микроскопических изменений, характерных для ОРДС.

По совокупности данных лабораторных, клинико-инструментальных и морфологических показателей контрольных групп животных (патология без лечения) можно заключить, что представленная модель ЛПС-индуцированного повреждения легких в полной мере соответствует острому респираторному дистресс-синдрому.

В сравнении с группой негативного контроля (патология без лечения) наблюдалось снижение общего количества лейкоцитов на 64%, уровня TNFα на 77%, уровня IL-6 на 46%, уровня муцина MUC5AC на 33%, гистологических признаков воспаления по сумме баллов на 35% и количества бокаловидных клеток.

При этом на фоне терапии дексаметазоном наблюдалось статистически значимое снижение доли макрофагов, ответственных за разрешение острого воспаления.

Затем была проведена оценка противовоспалительной активности эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu в различных дозах, схемах и путях введения по динамике лабораторных критериев: уровни провоспалительных цитокинов в плазме крови и бронхоальвеолярном лаваже, количество лейкоцитов, муцина и морфологических признаков воспаления в легких.

Возраст лабораторных животных на начало введения объектов исследования составлял 8-10 недель, а диапазон значений массы тела: 160-220 г для внутримышечного, внутривенного и эндотрахеального введения лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu.

В эксперименте было исследовано две схемы применения лекарственного препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu: лечебная и лечебно-профилактическая.

Рассмотрим результаты исследования при трех путях введения препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu - подкожном, внутримышечном и эндотрахеальном.

Внутримышечный путь введения препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr- Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu.

При внутримышечном пути введения препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu модельная патология характеризовалась снижением массы тела, лейкоцитозом БАЛ с преобладанием фракции нейтрофильных гранулоцитов, выработкой провоспалительных цитокинов (TNFα в сыворотке и IL-6 в БАЛ), увеличением количества муцина в БАЛ и наличием выраженных микроскопических признаков острого воспалительного процесса в легких, включая гиперплазию бокаловидных клеток.

Препарат позитивного контроля дексаметазон в дозе 5 мг/кг при внутрижелудочном курсовом введении оказал положительное влияние на течение ОРДС у крыс: наблюдалось статистически значимое снижение уровня лейкоцитов на 70% в БАЛ через 48 ч после индукции воспаления и уровня TNFα в сыворотке на 63% через 4 ч.

Микроскопический анализ легких подтвердил снижение острого воспалительного процесса по сравнению с контрольной группой и гиперплазию бокаловидных клеток по сумме баллов до 32%.

Введение препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu по лечебной схеме характеризовалось снижением уровня лейкоцитов в БАЛ, статистически значимым снижением на 18% доли гранулоцитов в бронхоальвеолярном лаваже в дозе 1 мг/животное, статистически значимым снижением уровня TNFα в сыворотке через 4 ч на 51%, уровня муцина в БАЛ через 48 ч после индукции воспаления на 45%, снижением количества бокаловидных клеток в дозе 1 мг/животное.

Микроскопический анализ легких показал существенное снижение картины острого воспаления - по сумме баллов на 27% в дозе 1 мг/животное.

Аналогичная картина наблюдалась при использовании лечебно-профилактической схемы введения препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu.

Наблюдалось снижение общего количества лейкоцитов в БАЛ, статистически значимое снижение уровня TNFα в сыворотке в дозе 0,2 мг/животное и уровня муцина в БАЛ в дозе 1 мг/животное.

На фоне введения препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu по лечебно-профилактической схеме также наблюдалось уменьшение признаков острого воспаления, включая снижение гиперплазии бокаловидных клеток.

Таким образом, модель острого респираторного дистресс-синдрома у крыс характеризовалась угнетением общего состояния животных и статистически значимым снижением массы тела через 48 ч после эндотрахеального введения ЛПС от 1 до 15 мг/кг.

Препарат позитивного контроля Дексаметазон, классический представитель глюкокортикостероидов, в дозе 5 мг/кг при внутрижелудочном курсовом введении обладал прогнозируемой эффективностью.

На фоне его применения на всех четырех этапах исследования наблюдалось снижение инфильтрации лейкоцитов, выработки провоспалительных цитокинов TNFα и IL-6, количества муцина в гомогенатах тканей легких, а также уменьшение признаков острого воспалительного процесса в легких при макро- и микроскопическом исследовании.

Данные интактной группы, группы негативного контроля (патология без лечения) и позитивного контроля (дексаметазон) свидетельствовали о корректном проведении данного исследования.

Эндотрахеалъный путь введения препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr- Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu.

Патология в контрольной группе характеризовалась аналогично предыдущему этапу эксперимента статистически значимым снижением массы тела в сравнении с исходным уровнем, инфильтрацией лейкоцитов, преимущественно нейтрофильных гранулоцитов в БАЛ, выработкой провоспалительных цитокинов TNFα и IL-6, образованием муцина и микроскопическими изменениями ткани легких, характерными для ОРДС.

Внутрижелудочное введение препарата Дексаметазон в дозе 5 мг/кг привело к значительному снижению признаков острого воспалительного процесса. Наблюдали статистически значимое снижение уровня лейкоцитов в БАЛ, уровней TNFα в сыворотке через 4 ч после индукции патологии и уровня IL-6 в бронхоальвеолярном лаваже через 48 ч. На фоне применения препарата дексаметазон снижалась выработка муцина, наблюдалось статистически значимое улучшение микроскопической картины поражения легких.

На данном этапе эксперимента наблюдалось гибель животных, вероятно, связанная с общими суммарными объемами введения и возможным механическим повреждением дыхательных путей при многократном эндотрахеальном введении. Эндотрахеальное введение является сложной и достаточно травматичной манипуляцией для животных, что отразилось в более значительном снижении массы тела при лечебно-профилактической схеме применения.

На фоне эндотрахеального введения лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu по лечебной схеме наблюдалось снижение общего количества лейкоцитов, снижение доли нейтрофильных гранулоцитов и одновременно увеличение доли макрофагов. Установлено статистически значимое снижение уровня муцина в гомогенатах тканей для дозы 0,2 мг/животное. На фоне эндотрахеального введения наблюдалось улучшение микроскопической картины повреждения легких.

При лечебно-профилактической схеме применения не было зафиксировано изменений количества лейкоцитов в БАЛ. Отмечали статистически значимое снижение уровня TNFα через 4 ч после введения ЛПС, уровня муцина в гомогенатах тканей статистически значимо в дозе 0,2 мг/животное и микроскопических признаков острого воспаления легких.

Обе схемы введения были в целом сопоставимы по эффективности.

Внутривенный путь введения препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr- Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu.

Результаты группы негативного контроля (патология без лечения) на этом этапе были в целом аналогичны двум предыдущим этапам. В ответ на эндотрахеальное введение ЛПС в дозе до 15 мг/кг у животных наблюдали снижение массы тела, выраженный нейтрофильный лейкоцитоз, значимое увеличение уровня провоспалительных цитокинов в сыворотке крови (TNFα через 4 ч) и бронхоальвеолярном лаваже (IL-6 через 48 ч.), увеличение содержания уровня муцина в гомогенатах легких, а также яркие микроскопические изменения легких по типу легочной нейтрофильной пневмонии, сопровождающиеся гиперплазией бокаловидных клеток.

Дексаметазон, как препарат положительного контроля, оказал прогнозируемый терапевтический эффект. В этой группе животных наблюдали статистически значимое снижение уровня лейкоцитов на 73% в сравнении с контрольной группой, значимое снижение уровней провоспалительных цитокинов (TNFα на 53%), IL-6 на 51%), а также уровня муцина в гомогенатах тканей легких (на 32%). Терапевтический эффект был подтвержден улучшением микроскопической картины воспаления легких.

Данный этап характеризовался высокой смертностью животных на фоне внутривенного введения препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu. Наиболее вероятно гибель животных была связана непосредственно с внутривенным введением препарата и проявлением токсических эффектов при данном пути введения. Изменения массы тела были наиболее выражены при лечебно-профилактической схеме применения, где для дозы 0,2 мг/животное было достигнуто статистически значимое снижение данного показателя.

Было выявлено дозозависимое снижение количества лейкоцитов при лечебной схеме применения (уровня IL-6 в бронхоальвеолярном лаваже и уровня муцина в гомогенатах легких. Микроскопический анализ легких показал существенное и значимое снижение острого воспалительного процесса в дозе 1 мг/животное. Результаты использования препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu по лечебно-профилактической схеме введения были в целом сопоставимы с лечебной схемой применения.

Таким образом, в группах животных, получавших тестируемый препарат на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu при внутримышечном, внутривенном или эндотрахеальном путях введения по лечебной и лечебно-профилактической схемам наблюдалось улучшение течения ОРДС в разной степени.

Пример 1 осуществления способа. При внутримышечном введении лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu для экспериментальной профилактики и/или терапии ОРДС.

Для осуществления внутримышечного введения лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu 40 самцам крыс для моделирования патологии эндотрахеально вводили ЛПС в объеме от 1 до 15 мл/кг без применения средств наркоза.

На каждой временной точке эвтаназии у животных отбирали кровь из сердца для получения сыворотки и бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ). Непосредственно после забора биологического материала у крыс извлекали легкие для макроскопической оценки острого повреждения легких. Бронхоальвеолярный лаваж отбирали трехкратным промыванием легких через трахею фосфатно-солевым раствором с 0,1 mM ЭДТА, суммарный объем 3 мл. Определяли общее количество лейкоцитов (с помощью гематологического анализатора) и лейкоформулу (с помощью гематологического анализатора и микроскопии мазка) в образцах БАЛ. В сыворотке крови и в образцах БАЛ определяли уровни IL-6 и TNFα.

Максимум инфильтрации БАЛ лейкоцитами наблюдали через 24 ч при введении ЛПС в дозе от 10 мг/кг до 15 мг/кг. Статистически значимые отличия в сравнении с группой контроля наблюдали через 8 и 24 ч для дозы 10 мг/кг и через 8, 24 и 48 ч для дозы 15 мг/кг.

Введение препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu по лечебной схеме характеризовалось статистически значимым снижением на 18% доли гранулоцитов в бронхоальвеолярном лаваже в дозе 1 мг/животное, статистически значимым снижением уровня TNFα в сыворотке через 4 ч на 51%, уровня муцина в БАЛ через 48 ч после индукции воспаления на 45%, снижением количества бокаловидных клеток в дозе 1 мг/животное. Микроскопический анализ легких показал существенное снижение картины острого воспаления - по сумме баллов на 27% в дозе 1 мг/животное.

Аналогичную картину наблюдали при использовании лечебно-профилактической схемы введения препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu. Наблюдалось снижение общего количества статистически значимое снижение уровня TNFα в сыворотке в дозе 0,2 мг/животное и уровня муцина в БАЛ в дозе 1 мг/животное. На фоне введения препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu по лечебно-профилактической схеме также наблюдали уменьшение признаков острого воспаления, включая снижение гиперплазии бокаловидных клеток.

Таким образом, при внутримышечном введении лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu для экспериментальной профилактики и/или терапии ОРДС было зафиксировано снижение уровня провоспалительного цитокина TNFα в сыворотке крови животных от 113,8 до 233,06 пг/мл, снижение уровня провоспалительного цитокина IL-6 от 0,796 до 1,76 пг/мкг белка в бронхоальвеолярном лаваже животных, снижение уровня лейкоцитов в бронхоальвеолярном лаваже животных от 2,29 - 4,56 × 10⁶ клеток/мл с преобладанием фракции нейтрофильных гранулоцитов до 80-90%, снижение уровня муцина MUC5AC в гомогенате легкого до 13,55 -25,22 нг/мг.

Пример 2 осуществления способа. При эндотрахеальном введении лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu для экспериментальной профилактики и/или терапии ОРДС.

Патология в контрольной группе характеризовалась аналогично предыдущему примеру статистически значимым снижением массы тела в сравнении с исходным уровнем, инфильтрацией лейкоцитов, преимущественно нейтрофильных гранулоцитов в БАЛ, выработкой провоспалительных цитокинов TNFα и IL-6, образованием муцина и микроскопическими изменениями ткани легких, характерными для ОРДС.

Эндотрахеальное введение является сложной и достаточно травматичной манипуляцией для животных, что отразилось в более значительном снижении массы тела при лечебно-профилактической схеме применения.

На фоне эндотрахеального введения препарата на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu по лечебной схеме наблюдали снижение общего количества лейкоцитов, снижение доли нейтрофильных гранулоцитов и одновременно увеличение доли макрофагов. Установлено статистически значимое снижение уровня муцина в гомогенатах тканей для дозы 0,2 мг/животное. На фоне эндотрахеального введения наблюдали улучшение микроскопической картины повреждения легких.

При лечебно-профилактической схеме применения не было зафиксировано изменений количества лейкоцитов в БАЛ. Отмечали статистически значимое снижение уровня TNFα через 4 ч после введения ЛПС, уровня муцина в гомогенатах тканей статистически значимо в дозе 0,2 мг/животное и микроскопических признаков острого воспаления легких.

Таким образом, при эндотрахеальном введении лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu для экспериментальной профилактики и/или терапии ОРДС было зафиксировано снижение уровня провоспалительного цитокина TNFα в сыворотке крови животных от 59,11 до 262,75 пг/мл, снижение уровня провоспалительного цитокина IL-6 от 1,078 до 2,034 пг/мкг белка в бронхоальвеолярном лаваже животных, снижение уровня лейкоцитов в бронхоальвеолярном лаваже животных от 1,22-5,69×10⁶ клеток/мл с преобладанием фракции нейтрофильных гранулоцитов до 80-90%, снижение уровня муцина MUC5AC в гомогенате легкого до 11,7 -27,62 нг/мг оценивают эффективность лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu для экспериментальной профилактики и/или терапии ОРДС.

Пример 3 осуществления способа

При внутривенном введении лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu для экспериментальной профилактики и/или терапии ОРДС.

Результаты группы негативного контроля (патология без лечения) на этом этапе были в целом аналогичны двум предыдущим этапам. В ответ на эндотрахеальное введение ЛПС в дозе до 15 мг/кг у животных наблюдали снижение массы тела, выраженный нейтрофильный лейкоцитоз, значимое увеличение уровня провоспалительных цитокинов в сыворотке крови (TNFα через 4 ч) и бронхоальвеолярном лаваже (IL-6 через 48 ч), увеличение содержания уровня муцина в гомогенатах легких, а также яркие микроскопические изменения легких по типу легочной нейтрофильной пневмонии, сопровождающиеся гиперплазией бокаловидных клеток.

Отмечалось дозозависимое снижение количества лейкоцитов при лечебной схеме применения лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu, уровня IL-6 в бронхоальвеолярном лаваже и уровня муцина в гомогенатах легких. Микроскопический анализ легких показал существенное и значимое снижение острого воспалительного процесса в дозе 1 мг/животное. Результаты использования препарата лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu по лечебно-профилактической схеме введения были в целом сопоставимы с лечебной схемой применения.

Таким образом, при внутривенном введении лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu для экспериментальной профилактики или терапии ОРДС было зафиксировано снижение уровня провоспалительного цитокина TNFα в сыворотке крови животных от 188,28 до 335,71 пг/мл, снижение уровня провоспалительного цитокина IL-6 от 0,641 до 2,612 пг/мкг белка в бронхоальвеолярном лаваже животных, снижение уровня лейкоцитов в бронхоальвеолярном лаваже животных от 0,51- 4,34×10⁶ клеток/мл с преобладанием фракции нейтрофильных гранулоцитов до 80-90%, снижение уровня муцина MUC5AC в гомогенате легкого до 11,73 - 23,77 нг/мг.

Из совокупности полученных данных следует, что препарат на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu обладает выраженными терапевтическими свойствами, что делает его высокоперспективным лекарственным средством для лечения ОРДС, который в свою очередь является частым осложнением у пациентов с тяжелой формой COVID 19.

Список источников информации

1. Клинические рекомендации. Диагностика и интенсивная терапия ОРДС. Утверждены Президиумом Общероссийской общественной организацией «Федерация анастезиологов-реаниматологов». Утверждены 30.03.2021, рекомендация 67 стр. 62-63, стр. 7, рекомендация 57 стр. 55 [1].

2. Thomas Tschernig and other. Lipopolysaccharide induced inflammation in the perivascular space in lungs. Journal of Occupational Medicine and Toxicology volume 3, Article number: 17 (2008), published: 30 July 2008 [2].

3. Andrea Fiala and others. Treatment of a Rat Model of LPS-Induced ARDS via Peritoneal Perfusion of Oxygen Microbubbles. Journal of surgical research. 13.09.2019 [3].

Изобретение относится к медицине и касается способа профилактики или терапии острого респираторного дистресс-синдрома на модели индуцированного ОРДС у лабораторных животных, смоделированного с помощью липополисахарида, путем его эндотрахеального введения с последующим индуцированием воспалительного клеточного сигнального пути и применением экспериментальной профилактики или терапии ОРДС, заключающейся во введении до или после моделирования ОРДС лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu в дозе от 0,2 мг до 1 мг на каждое животное. Изобретение обеспечивает снижение риска зависимости результатов терапии от способов введения лекарственного средства; снижение токсических эффектов терапии ОРДС; повышение резистентности организма при лечении ОРДС в отношении инфекций, вызванных вирусами, бактериями и грибами; ингибирование воспалительных цитокинов, обуславливающих ОРДС. 2 з.п. ф-лы, 3 пр.

1. Способ профилактики или терапии острого респираторного дистресс-синдрома на модели индуцированного ОРДС у лабораторных животных, смоделированного с помощью липополисахарида, путем его эндотрахеального введения с последующим индуцированием воспалительного клеточного сигнального пути и применением экспериментальной профилактики или терапии ОРДС, заключающейся во введении до или после моделирования ОРДС лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu в дозе от 0,2 мг до 1 мг на каждое животное, причем способ включает следующие стадии:

- моделирование индуцированного ОРДС путем введения липополисахарида в дозе от 1 до 15 мг/кг на каждое животное;

- измерение через 48 часов после введения липополисахарида уровня провоспалительного цитокина TNFα в сыворотке крови, уровней провоспалительного цитокина IL-6 и лейкоцитов в бронхоальвеолярном лаваже, а также уровня муцина MUC5AC в гомогенате легкого; и

- при повышении уровня провоспалительного цитокина TNFα в сыворотке крови животных до 59,11-235,71 пг/мл, повышении уровня провоспалительного цитокина IL-6 до 0,641-2,034 пг/мкг белка в бронхоальвеолярном лаваже животных, повышении уровня лейкоцитов в бронхоальвеолярном лаваже животных до 0,51-5,69×10⁶ клеток/мл с преобладанием фракции нейтрофильных гранулоцитов до 80-90%, повышении уровня муцина MUC5AC в гомогенате легкого до 11,7-27,62 нг/мг осуществляют последовательное введение животному через 1 час, 8 часов, 25 часов и 33 часа после моделирования ОРДС лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu.

2. Способ профилактики или терапии острого респираторного дистресс-синдрома на модели индуцированного ОРДС у лабораторных животных по п. 1, отличающийся тем, что экспериментальную профилактику ОРДС проводят у лабораторных животных лекарственным средством на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu, путем его двухкратного введения за 24 часа и 16 часов до моделирования.

3. Способ профилактики или терапии острого респираторного дистресс-синдрома на модели индуцированного ОРДС у лабораторных животных по п. 1, отличающийся тем, что введение лабораторным животным лекарственного средства на основе эзрин-пептида Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu осуществляют путем его внутривенного или внутримышечного, или эндотрахеального введения.